生物节律的产生机制

生物体运动的节奏和规律，以及与昼夜交替和四季更迭有关的生命现象，如同钟表报时一样定时发生。因此，人们把控制生命体各种节律的时间机构称为“生物钟”。

通过对生物节律的研究发现，生物体确实存在与日常意义的时钟相类似的管理机制，它们使昼夜周期的误差常常可以精确到数分钟。例如，在危地马拉有一种第纳鸟，它每过30min就会叫一阵，误差只有15 s，被称为“鸟钟”；在非洲的密林里有一种报时虫，它每过1h就变换一种颜色，被称为“虫钟”；在南非有一种树，它的叶子每隔30min就翻动一次，被称为“活树钟”；在阿根廷有一种野花，每到初夏20:00左右便纷纷开放，被称为“花钟”。

人类正常的生理活动也有节律性波动，不仅有高频节律（周期从毫秒到秒的节律，如脑电、心电），也有低频的节律（周期可以是昼夜、月、年的节律）。在形态结构上，细胞的形态组分、细胞增殖及细胞内RNA、DNA、cAMP类都有节律性变化；在生理指标上，体温、睡眠、心功能、肺功能、动脉血压、排尿量、心理行为等均表现出节律性特征；在生物化学水平，各种激素的血浆浓度（包括皮质醇、促肾上腺皮质素、胰岛素、肾素、血管紧张素、肾上腺素、去甲肾上腺素、甲状腺素、褪黑素、内啡肽、性激素、中枢神经递质等）都呈现节律性变化。这种与生物体共同存在的节律性是生命的基本特征之一。

生物体的节律特征是长期进化过程中形成的，与外界环境有关。但在人工模拟的实验条件下，许多生物节律仍保持原有的节律性。提示机体内部存在控制生物节律的时间机构。在探讨生物节律形成机制的过程中，许多学者提出了各种“生物钟”学说。

（一）关于生物节律产生机制的学说

1．外源性假说　无论是我国传统医学理论还是现代时辰生物学对生物节律的认识，都注意到生物节律的一个普遍特征，即在正常生活环境中，生命活动的原节律一般都与环境的某种节律性变动有相同或相似的周期，并形成比较稳定的相位关系。这些复杂的宇宙信息是构成控制生命节律现象的动因。生物体生存环境中的电场、地磁、重力场、宇宙射线，行星运动周期、光照及月球引力等的规律性变化，导致了机体的生命节律周期性。因此，认为生物的周期性直接受环境条件周期性变化的调制，体内并不存在定时机制，即生物节律是外源性的，这就是所谓的“外生钟假说”。

外源性假说认为生物的拟昼夜节律并不能证明是内源的，因为还有许多其他能够影响节律的物质力量在自然环境中起作用，其中还可能存在目前科学界还不清楚的有节律的力量。外源论的一个重要根据是从马铃薯的实验中得到的。当马铃薯被保存在恒压、恒温条件下时，其代谢率仍随月球和大气压的各种变化而改变；马铃薯所消耗的能量也可以反映外界的平均温度；马铃薯的呼吸变化与宇宙射线的变化是有关联的。

2．内源性假说　生物节律是在亿万年生物进化中形成的，因为生物进化是在地球这一特定环境中，它有昼夜、四季和年等的周期性变化，各种生物为了生存而逐渐形成了适应这种节律性变化的能力，并将这种信息通过遗传因子代代相传，构成了现在具有的生物节律。生物时间节律又与各个细胞有关，在昼夜不同时间中，各种细胞生成的蛋白质不一致，因此，机体中每个细胞都是生物节律的基本结构。而机体的昼夜节律由肾上腺等器官为起点，经视交叉上核（可能是脑的时间信号来源）等校正器进行调整，使生物节律能够随外界因素（如明暗周期、进食次数等）多种因素而变化。由此得出的结论：尽管在生命起源和生物进化的早期，天体和地球物理因素的周期性变化是生物节律形成的根本起因，而且至今对生物节律仍存在重要的影响，但现存生物的绝大多数生理节律已由机体中有测时功能的机构所发动和控制，称为生物体本身的内源性节律，即机体生命活动主动变化的固有规律，此为“内源钟假说”。

内源学说的观点认为，生命的有机体能自我预知时间，完全不依赖环境中的周期性变化。精确的生物节律依赖不断得到生存环境中光、温度、潮汐等节律的校正，进而实现和外界环境的节律保持同步。因此，生物钟运转的速度在改变环境条件（温度、光照强度等）时会被调快或拨慢。

将在自然条件下生活的生物（动物或植物）分别移到人工创造的永远是白天和永远是黑夜的两个实验室里观察，结果发现，生物依然保持它们原有的时间规律，少则数日，多则几个月。对动物昼夜活动节律的研究还发现，许多动物在活动时间内为双高峰活动型，双高峰之间的不活动阶段通常和环境中一些对机体不利的因素相关。这段不活动时期对昼行性动物而言是在正午以后，对夜行动物而言是在午夜以后。第一活动高峰与黎明或黄昏的朦胧之光有关，所以有些人认为这些活动高峰是环境刺激的直接结果。但是，在恒温和人工光照（明暗变化是迅速的）条件下，这些活动高峰并未消失。提示双峰形活动节律是内源性的，已不受环境条件变化的影响。

生物体内具有产生并控制生物节律的机制，其核心是一组能自律性地产生振荡信号的脑内神经结构，即振荡器（oscillator），其中具有主导作用的被称为起搏器或起搏点（pacemaker）。振荡器通过特定的感受器和感觉传入通路，接受环境授时因子的影响，以调整自身的振荡节律，使其与环境节律同步；同时，它发出振荡信号（周期性变化的神经信号或体液因素）影响机体的生理功能，使它们的活动按特定的节律进行，形成生物测时机制和生物节律振荡系统（oscillatory system）。

最近的研究表明，除了中枢的视交叉上核起搏作用外，其他内在的振荡器在外周组织（如心、肝、肾等器官）也表达，在胚胎组织和孤立的细胞中也有表达。由此认为细胞的自主节律生物钟在机体的每个细胞中存在。外周生物钟不是独立于视交叉上核的，而是由视交叉上核的调控来完成各自的节律。视交叉上核控制外周生物钟的机制仍不清楚，可能是神经和体液信号的综合作用。

内源性生物钟应当由三部分组成：①中央昼夜节律振荡器，自发产生有节奏的信号；②联系振荡器和外界时间信号的输入通道；③使生理过程和行为同步化的输出通道。在哺乳动物主要由位于下丘脑基底部的视上核控制昼夜起搏器。昼夜循环产生的光线变化是设定动物视上核活动的主要因素。因此昼夜节律时间是用光照后时间（hours after light onset，HALO）来表达，而不是用时钟时间来表达。

3．第二生物钟学说　区别于人体最初形成的和总体的生物钟节律（又称第一生物钟节律，或主节律）。机体的细胞几乎都具有第二生物钟，按照太阳的升落来制造蛋白质。比如，强迫一只大鼠连续数天由晚间进食改为白天进食，其肝脏生物钟就会逐渐放慢制造帮助消化解毒酶的周期，以适应新的作息时间。程序的颠倒只会发生在肝脏、肾脏和胰腺中。因为人体的主生物钟仍然按照最初的节律发挥作用。提示主生物钟通过确定的“化学和激素信号”来调节第二生物钟的时间。

（二）昆虫的生物钟

研究发现，昆虫的生物钟有两种，包括光授时因子感受器，即复眼中视网膜的生物钟，称为“具有视网膜性光感受器的生物钟”，以及光感受器，即脑内一些具有感光功能神经元的生物钟，称为“具有视网膜外光感受器的生物钟”。

1．具有视网膜性光感受器的生物钟　生活史中发生不完全变态昆虫的生物钟多属此类。蟑螂的活动具有明显的昼伏夜行节律，这种昼夜节律是由脑内生物钟控制的。实验研究发现，破坏蟑螂脑的视叶或间脑，其活动的昼夜节律消失；破坏复眼或视神经，其活动仍保持近似昼夜节律，但此节律不能与环境的昼夜明暗节律同步，即呈自激振荡状态，破坏单眼则无此效应。由此进一步研究得知，蟑螂活动生物钟的振荡器位于视叶髓区，该区发出的神经性振荡信号首先传至间脑，间脑中有内分泌细胞，它们分泌的激素对蟑螂活动有抑制作用。来自视叶的神经性振荡信号，使间脑神经内分泌细胞的分泌呈昼高夜低的节律性变动，从而把神经性振荡信号转变为体液性振荡信号，由此来控制蟑螂的活动，使其呈现昼伏夜行的节律。来自复眼视网膜性光感受器（retinal photoreceptor）的环境授时因子信息，经视神经纤维传至视叶髓区，影响和调制其振荡节律，使之与环境昼夜节律同步。

2．具有视网膜外光感受器的生物钟　生活史中发生完全变态的昆虫，其复眼是在成虫阶段才出现的器官，而其生物节律在幼虫阶段即已开始，因此，其生物钟的光感受器不可能是复眼，而是那些在幼虫阶段就已具备的器官或神经组织，即视网膜外的光感受器（extraretinal photoreceptor）。控制蚕蛹羽化节律的生物钟，就是具有视网膜外光感受器的生物钟。昆虫由蛹变态为成虫的过程称为羽化（eclosion）。很多昆虫的羽化，仅发生在一天中的某一特定时刻。就群体而言，是集中发生在一天中的某一段时间内。羽化的这种时间规律称为羽化节律（emergence rhythm）。将发生羽化的这一特定时间称为羽化的时间闸门（circadian gate）。时间闸门有种属特异性，并受光、温度、湿度等因素的影响。例如，柞蚕（Antheraea pernyi）羽化的高峰出现于下午（明期后半），而天蚕（Hyalophora cecropia） 的羽化高峰出现于上午（明期前半）。如将脑摘除后，两种蚕的羽化节律都消失，羽化随机地发生于一天中的任何时间；如将脑取出后移植到同一个体的腹部，则可在很大程度上保持原有的羽化节律；如将两种蛹的脑摘出后做交互移植，则其羽化各自呈现出供脑者的节律特征。这种羽化节律表明控制羽化节律的生物钟存在于脑内。

（三）鸟类的生物钟

鸟类具有感知和测定时间的能力，鸟类的活动也具有与环境昼夜交替同步的节律。比如雄鸡唱晓等。

1．视交叉上核　有些鸟类，在摘除松果体后其活动的近日节律并不完全消失（如鸽和白头翁），或者完全不受影响（如鸡等），说明除松果体外，鸟类还有其他生物节律振荡器存在。

破坏文鸟（mannikin）的视交叉上核而保存松果体，在无明暗交替的恒定条件下，它们的近日节律也会消失。鸟类的视交叉上核接受直接来自视网膜的神经纤维，它们可通过这些纤维获得环境明暗节律的信息。能够获得环境节律的时间信息是作为生物节律振荡器所必须具备的条件之一。因此，鸟类的视交叉上核被认为是除松果体外的另一个近日节律振荡器。

2．松果体　许多实验研究表明，鸟类松果体褪黑素的分泌具有自动节律性。孵化后即被置于明暗交替条件下的日龄为10～14d的雏鸡，其褪黑素合成酶的活性呈现明显的夜高昼低的节律变化；在离体培养的鸡松果体的褪黑素合成酶的活性仍然具有明显的昼夜节律；给因松果体摘除而消失活动节律的文鸟重新移植一个松果体后，其活动的近日节律会得到恢复，而且这种新恢复的节律具有供体的节律和相位特征（如供体的节律与受体摘除松果体前的节律是反相的，那么移植松果体后受体出现的节律也与其原有节律相反）。此外，摘除松果体后的动物，活动量往往增加，而注射褪黑素后则活动减少。因此，褪黑素很可能就是松果体发出的近似昼夜节律的振荡信号。

Gwinner等认为鸟类的生物钟由两级振荡器组成：第一级为主振荡器，又称为主钟（master clock），如自动节律性很强的松果体；第二级为多个相互偶联的从动振荡器（slave oscillator），如视交叉上核、视网膜、下丘脑等，它们也有一定的自律性。主振荡器通过其振荡信号去调制各从动振荡器的振荡，使它们的节律一致并与环境节律同步。当主振荡器失去作用时（如破坏松果体后），生物节律由各从动振荡器协调控制，此时机体的节律能否保持正常，则视各从动振荡器之间的偶联关系是否牢固。此模型能较合理地解释摘除松果体对各种鸟类的不同影响。

3．鸟类的光感受器　除视觉器官外，鸟类的松果体既有内分泌功能，又有感光功能。鸟类生物钟用以调整振荡节律使之与环境节律同步的环境光信息既来自视网膜，也来自松果体和下丘脑等处的视网膜外光感受器。McMillan等发现，在LD 12:12（明期照度仅为0.03 lx）的情况下，75%的正常家雀可与环境明暗节律同步；其余25%则可能因为对光的敏感性较差，未与环境节律同步。如将后者头顶部的毛拔去，以增加直接进入颅内的光量，它们的活动即可与上述明暗节律同步。而在前者的头皮下注入墨汁，以阻止光线由此进入颅内，结果又使得它们与上述明暗节律失同步。这些实验结果提示，家雀脑内的神经结构可能具有直接感受光刺激的能力。进一步的研究结果表明，这些神经结构是松果体或下丘脑。如将松果体离体培养，松果体细胞的活动（褪黑素的合成与分泌）仍能与环境明暗节律同步；如把发光小体埋植于鸟的下丘脑可影响其光周反应。提示松果体和下丘脑等可能就是颅内的视网膜外光感受器。

（四）哺乳动物的生物钟

时间机构是证明生物节律具有内源遗传性的物质基础，它存在于机体内部，是推动和组合各种节律活动的系统，系统内有一个或几个起搏点或称起搏器。系统可以接受环境明暗变化的信息，或环境明暗周期相位发生改变时（如跨时区旅行）调控起搏点振荡，经神经和体液途径把调整后的信号传至各器官，以控制机体各种生命过程的节律活动，使之与环境同步；在机体与环境明暗周期变化隔绝时（如使动物致盲等），仍可维持各种节律活动，即自激节律。现已证实哺乳动物的起搏点位于下丘脑视交叉上核。破坏大鼠等啮齿类动物的视交叉上核后，各种生命活动的近日节律即消失。提示哺乳动物视交叉上核可能作为昼夜节律的振荡器，接受来自视网膜的光授时因子。同时也证明生物节律是由基因决定的，运用遗传工程基因移植和重组技术，可消除或重现果蝇的孵化和运动等昼夜节律。

1．视交叉上核　与鸟类相反，包括人类在内的哺乳动物的松果体和下丘脑不可能成为视网膜以外的光感受器。人类对于光的感受主要来源于视网膜（当然有实验显示人体的其他部位也具有光感效应并可影响生物钟，但那些部位不可能作为正常的光信号接收器官）。视网膜接受光刺激，通过视网膜下丘脑束将信号传递到生物节律中枢——视交叉上核。接受光刺激的是位于视网膜深层的含有视黑素（melanopsin）的视网膜神经节细胞。视黑素和其他视蛋白一样，在第7个跨膜结构域的赖氨酸残基上，存在11-顺-视黄醛（11 cis retinaldehyde）。视黑素作为视蛋白的光色素，光照可以使11-顺-视黄醛异构化，从而激活G-蛋白信号级联反应。视黑素神经节细胞与其他视网膜神经细胞分离时也能够对光产生反应。这些细胞对光的反应在许多方面与视锥和视干细胞不同。首先，视黑素的神经节细胞对光的反应为去极化，而视锥、视干细胞为超极化；其次，分离培养的视黑素神经节细胞对光刺激的反应曲线为视蛋白介导的反应，其最敏感的波长大约为484nm，明显与视锥细胞和视干细胞不同。此外，含视黑素的神经节细胞对持续光照的反应呈明显的持续性，而视锥、视干细胞在这种情况下则具有适应性。视黑素神经节细胞对光的反应比视锥和视干细胞的域值高，而且反应速度很慢，在光照1min后才出现去极化。

（1）视交叉上核的解剖关系：视交叉上核是下丘脑前方的核团，位于视交叉上方、第三脑室底的两侧。其传入纤维中有直接来自视网膜的纤维和来自外侧膝状体腹侧部的纤维，这些纤维使视交叉上核能够获得环境授时因子的信息。来自下丘脑其他部位的纤维、来自中脑中缝核的5-羟色胺能纤维、来自黑质的多巴胺能纤维、来自脑干的去甲肾上腺素能纤维和来自大脑边缘系统（如海马）的纤维等，使视交叉上核能够广泛地获取脑内其他系统的信息。视交叉上核的传出纤维可分为四路：第一路向后下方行走，主要到弓状核；第二路向两侧到视上核及其周围；第三路从背侧发出，到室旁核等部；第四路向前方投射到视前区。通过这些纤维，视交叉上核可将其振荡信号传给其他功能系统。

（2）视交叉上核的生理作用：实验显示，视交叉上核电位活动具有明显的昼夜节律，无论昼行动物和夜行动物，这些电位活动的节律都是昼强夜弱。尽管中脑网状结构、丘脑内侧核、丘脑、黑质等神经元的活动也具有昼夜节律，但这些部位的活动节律与视交叉上核的节律相位相反，且振幅也小。如果将包括视交叉上核在内的下丘脑区域与脑的其他部位间的联系切断，制备成所谓的“下丘脑岛（hypothalamic island）”，此时视交叉上核神经元的活动仍保持原有节律不变，而岛外其他脑区的活动则不再具有昼夜节律。这些结果提示视交叉上核具有自主发生节律性振荡的能力，并且是脑内节律性活动的起搏点。

（3）破坏视交叉上核对机体近似昼夜节律的影响：有实验显示，在破坏视交叉上核后，大鼠饮水行为的近日节律消失。此后，许多研究者使用电解法、化学方法或免疫学方法破坏视交叉上核后，机体几乎所有生命活动的近日节律都会发生紊乱甚至消失。提示视交叉上核是哺乳动物近日系统（circadian system）的重要组成部分。

2．松果体　哺乳动物松果体中褪黑素的合成与分泌也具有明显的昼夜节律。位于丘脑背面结缔组织中的松果体可看作为一个重要的神经内分泌器官。该腺体有两大特点：①5-HT含量高，比其他脑区高100～200倍。原因在于松果体含有合成5-HT所需的全部酶系，且色氨酸羟化酶活性特别活跃。松果体还含有进一步处置5-HT的酶系，即SNAT和羟化吲哚-O-甲基转移酶（hydro-xyindole-O-methyltransferase，HIOMT），能够生成褪黑素。②5-HT代谢酶类活性可受许多外部因子控制，尤其交感神经系统。当交感神经兴奋时，释放的去甲肾上腺素作用于松果体的β受体，激活腺苷酸环化酶，使cAMP生物合成增加，后者激活SNAT，促进褪黑素的合成。

5-HT是睡眠清醒节律中的重要递质。在白昼，松果体中5-HT水平高而SNAT的活性低；当转为黑暗时，SNAT活性迅速增强。5-HT和褪黑素具有明显的近日节律，即使处于持续黑暗环境时，此节律仍然存在。但是，由于此节律可因视交叉上核的破坏而消失，所以一般认为，在鸟类以下的脊椎动物，曾经由松果体担任的生物钟功能，在哺乳动物已转由视交叉上核承担。尽管如此，松果体在哺乳动物的近日系统中仍然具有重要作用。例如，松果体可通过褪黑素对下丘脑促性腺区活动的抑制作用参与对性腺活动近似昼夜节律、年节律的调节。最近的研究认为，松果体以其节律性分泌的褪黑素作为一种内源性授时因子或同步因子，对机体某些生理功能的近日节律起导引作用。例如，有研究结果表明，褪黑素与脑内的阿片肽系统相互作用，从而调节机体镇痛机制的近日节律；外源性褪黑素可使机体节律的相位发生改变，并有稳定和恢复机体近日节律的作用等。

通过对高等动物所表现的昼夜节律多样性的分析，除了明暗变化外，进食和社会因素等的作用也很重要。事实上，仅靠视上交叉核是不可能控制生物体所有节律的，许多学者认为动物体内生物钟不止一个。改变大鼠喂料时间所致的昼夜节律变化和应用甲基苯异丙胺（methylamphetamine）所诱导的昼夜节律改变都与视交叉上核无关。即使除去视交叉上核，这两个节律仍然存在。这意味着，哺乳动物体内的视交叉上核，不是起搏点所在的唯一部位，起搏点还可能存在于生物体的其他层次。

（五）生物钟的分子生物学

控制生物体节律的生物钟由三部分构成：①生物振荡器由呈节律性表达的基因及其编码的蛋白质组成。节律基因启动后，经转录、翻译生成相应的蛋白质。当该蛋白质浓度达到一定程度时，反馈作用于自身基因的启动部位，使该蛋白质浓度高低以24h周期进行振荡。在昼夜振荡反馈回路中，正调节因子（positive element）启动生物钟基因，使之进行表达；负调节因子（negative element），阻断正调节因子的作用，使相关基因的表达减弱或停止。振荡器是生物钟运行的核心元件，通过接收外界授时因子的传入信号，引起相应的基因表达，进而控制生物钟信号的输出，使生物体的活动呈现昼夜节律性。②输入系统（input pathway）由感受器和传入路径组成，将授时因子的信号传入振荡器，调节相关基因的表达，矫正节律位相。最重要的授时因子为光照和温度变化。③输出系统（output pathway）包括与信号输出有关的钟基因和钟控基因（clock-controlled gene，CCG），将母钟节律振荡信号，经体液和神经通路送达效应器，调节生理、生化和行为的昼夜节律。

在视交叉上核的神经元中有一组与生物节律有关的基因，通过自身表达和调控形成一个自激振荡的环路而持续自激振荡，称为中央生物钟（central clock）。中央生物钟完成该自激振荡过程的一个周期约24h，形成了近日节律，然后通过传出途径将这种自激振荡产生的近日节律传导出去，形成机体各生物变量的近日节律。近年来还发现这种生物钟基因不仅在中枢神经系统产生振荡，而且在外周组织中同样存在生物钟自激振荡，称为外周生物钟（peripheral clock）。但是外周生物钟的近日节律通常受中央生物钟的调控，进而与中枢的近日节律保持同步。对生物钟模型的研究得知，昼夜生物钟是细胞自主的，即某些细胞具有生物钟的特征。在对生物钟的微观研究中，已经发现生物钟的调控基因和寿命基因，并在哺乳动物（包括人体）中定位和克隆出调控昼夜节律的生物钟基因（也称钟基因，circadian clock gene）。随着近日钟系统不断有新的基因发现，使近日钟学说得到不断完善。

1．生物钟基因　现已发现许多哺乳动物体内存在大量的近日节律基因。在众多的近日节律基因中，有一些基因参与生物钟的调控，并且这些基因的改变将引起生物节律的异常，我们把这些对维持生物体节律起关键性作用的近日节律基因称为生物钟基因，其表达产物称为钟蛋白（circadian clock protein）。

目前发现的对哺乳动物的生物钟调控起着重要作用的基因有Clock、Npas2、Mop3（Bmal1）、Mop9（Clif）、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Dec1、Dec2、Timless、Rev-erbα、Dbp和E4bp4等。这些基因的转录-翻译活动是形成日节律的分子生物学基础。

（1）Per基因：Per是果蝇的主控基因，影响昼夜节律和超日节律。Per经转录和翻译后，形成PER蛋白，组成钟的反馈回路。但其须与另一种钟蛋白组成异二聚体后，才能作为负性成分发挥作用。Per有3个变异的等位基因。第一种（Per1）为Pershort，其并不遵循24h节律，而是19h，其后代也如是；第二种（Per2）为Perlong，其周期为29h；第三种（Per3）为Per-，没有节律。鼠和人的Per1、Per2、Per3三种基因型在表达的部位和时相上存在差异。Per1在中枢表达，Per2在中枢和外周组织都有表达，Per3只在胚胎期有表达。另有研究认为，Per3基因可能不是维持近日节律环路所必需的，因为Per3基因被破坏的小鼠，并不影响其他近日节律基因的正常表达。

（2）Timeless基因：Tmeless首先在果蝇中被发现，在小鼠和人存在着与果蝇Timeless同源的基因，但它们并不具有果蝇Timeless的功能。后来发现哺乳动物的Timeless与果蝇的另一新基因Timeout（Tim-2）同源。最近的研究表明，哺乳动物的Timeless（dTim）在生物钟基因的核心调控环路中有反馈调节作用。

（3）Cry基因：Cry（cryptochromes）基因包括Cry1和Cry2，属于植物蓝光感受器（blue light receptor）和光解酶Cry2基因缺陷（photolyase）家族的成员。CRY蛋白在果蝇体内只作为光感受器存在。哺乳动物的CRY蛋白曾被认为是光感受器分子之一，与近日节律的光导引途径有关。但近来的研究发现，在全黑暗条件（DD）下Cry1或Cry2基因缺陷分别导致小鼠转轮运动的近日节律缩短和延长；在黑暗-光照交替条件（LD）下，两种缺陷型小鼠都表现为正常的24h节律；Cry1和Cry2基因都缺陷的小鼠，在DD条件下节律性消失。双缺陷型小鼠的mPer1在LD或DD条件下持续高水平表达但无节律性；mPer2的表达在LD条件下有节律性，但在DD条件下其表达呈现为非节律性的中间水平。根据上述观察认为，Cry1和Cry2是近日节律分子机制的重要组成成分。Cryl和Cry2的表达产物为核蛋白，具有稳定PER蛋白和介导PER蛋白入核的功能。

（4）Tim基因：Tim负责对Per转录后调节，如细胞核内定位、蛋白质稳定性等方面发挥作用。Per和Tim从午后开始转录水平提高，至黄昏时mRNA达高峰，PER和TIM蛋白的积累峰在6h后出现，两者形成异二聚体进入核内，作为负性成分发挥作用。黎明后光照作用使TIM降解，导致PER稳定性下降，致使PER：TIM对CLOCK：CYC的抑制作用降低，新的一轮循环开始。时辰生物学研究表明，光-暗周期可导引昼夜节律使其位相重调（reset）。如在Tim mRNA处于高峰稳定期的黑夜早期给果蝇光照，TIM被光解后可能迅速被新合成的TIM替补，系统推迟节律后再回到光照前的位点上，可使昼夜周期延长。在夜间晚期给予光照，由于大多TIM被光降解，此时正处于节律的低谷期，很少或无Tim mRNA替补，所以昼夜节律缩短。

（5）Rigui基因：在发现小鼠钟基因之后，美国贝勒医学院（Baylor College of Medicine）的研究人员在研究人17号染色体短臂上编码调节蛋白的DNA序列时克隆到一个新基因，其表达具备上述节律基因的基本特征并命名为日晷基因（rigui gene）。Rigui基因是一个单拷贝基因，但由于转录后的不同拼接，能产生3种不同大小的mRNA，分别是3.0，4.7和6.6 kb。用Northern杂交分析证明，Rigui基因具备生物钟基因应有的特征。用4.7 kb mRNA的cDNA作为探针在小鼠脑cDNA文库中得到m-Rigui基因，编码1 291个氨基酸残基，与人的RIGUI蛋白有92%的同源性。

生物钟基因在机体生理过程中发挥重要作用。例如在家族性提前睡眠时相综合征（familial advanced sleep phase syndrome，FASPS）中，PER2磷光体受体位点发生突变，导致睡眠、体温和褪黑素的节律变化提前4h。在PER3的基因编码序列中发现多态现象，其中一个单倍型与延迟睡眠时相综合征有明显的关系。

2．生物钟基因的调控　对于生物钟基因控制的研究还较少，主要是对下丘脑视交叉上核的研究。目前的研究认为，分子时钟的调控是基于几个时钟基因的转录-翻译反馈环路完成的。在哺乳动物生物钟的转录-翻译反馈环中，Clock基因和Bmal1基因的蛋白质产物是转录因子CLOCK和BMAL1，它们均具有碱性螺旋-环-螺旋-PAS（basichelix-loop-helix-PAS，bHLH-PAS）结构域，是近日节律分子机制的关键性组成成分，以异源二聚体的形式在反馈环中发挥重要的正调节作用。CLOCK-BMAL1异源二聚体与Per1、Per2、Per3、Cry1和Cry2基因启动子区的E-box（CACGTG）结合，以启动这些基因的转录，经翻译得到的PER、CRY蛋白将抑制CLOCK-BMAL1异源二聚体介导的转录。

以bHLH-PAS为基本结构的CLOCK与BMAL1蛋白是正调节因子，启动并促进一些节律基因的表达；CRY1、CRY2、PER1、PER2蛋白为负调节因子，抑制正性调节因子的作用，减弱这些节律基因的表达。

近日节律的自激振荡由多个反馈环组成，其中有2个环路是最主要的：①转录因子CLOCK和BMAL1通过bHLH与PAS（Per，Ahr/ARNT，Sim）结构域形成异二聚体，作为正性元件结合到节律基因Per1-3和Cry1-2上游启动子的E-box，从而激活基因转录，其表达产物PER和CRY系列蛋白质从胞浆转移至核内，PER和CRY蛋白可作为负性元件，与CLOCK和（或）BMAL1直接作用，抑制CLOCK-BMAL1的活性，从而抑制Per1-3和Cry1-2的转录，最终产生细胞新陈代谢和静止-活动循环（rest-activity cycle）的昼夜节律。②CLOCK和BMAL1异二聚体在激活Per和Cry的同时，也激活孤核受体（orphan nuclear receptor，ONR）rev-erbα基因转录，其表达蛋白REV-ERBα可与Bmal1启动子结合，阻遏Bmal1的转录。由于基因转录和蛋白质入核需一定时间，使生物节律分子振荡的周期正好维持在24h左右。这种分子振荡不但使许多节律基因Per1-3和Cry1-2等的表达呈现生物节律，而且使CLOCK和BMAL1异二聚体的转录活性也具有生物节律的特征。目前研究认为，正是CLOCK-BMAL1异二聚体通过调节和控制下游的钟控基因，使其呈现节律性表达，从而使生物节律的节律信号得以输出。