儿童肿瘤微小残留病的检测

随着现代医学科学的发展，外科手术、联合化疗、放射治疗、造血干细胞移植及生物免疫治疗等技术的综合应用已经使包括儿童急性白血病在内的儿童恶性肿瘤的预后得到了极大改善，已有相当一部分病例得到临床治愈。据统计在儿童急性白血病中，急性淋巴细胞白血病（ALL）的5年无病生存率（EFS）已达70%～90%，急性髓细胞性白血病（AML）的5年EFS也达40%～60%。神经母细胞瘤的3年EFS也达70%左右。而另一方面，在如此众多的治疗手段中选择最合适的疗法和治疗强度可能更为重要。按照肿瘤病理类型、细胞学类型及肿瘤细胞生物学特征的分型，如白血病的形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学（MICM）分型，已经使得儿童肿瘤的分型日趋精细。根据这些分型可以对各种肿瘤进行危险度分层，并指导临床医生选择合适的方案进行治疗。

诚然，目前的各种分型方法给儿童肿瘤的疗效提高作出了重要贡献。但是，所有上述的分型参数均只强调肿瘤发生时肿瘤本身的生物学特征。而实际上恶性肿瘤的治疗不仅仅与肿瘤细胞本身的生物学特征有关。仅就化疗而言，除了上述因素外，疗效还跟肿瘤细胞所处的周围环境有关，如骨髓基质细胞、肿瘤血液供应及患者机体对药物的代谢、分布、排泄个体差异有关。目前，我们还不能仅仅通过诊断式的一次检查确定所有可能因素对疗效的影响。但是既然这些因素可以影响疗效，那么我们可以在治疗中随时对患者进行监测，观察治疗中肿瘤细胞的清除速率或一个疗程后肿瘤细胞的残留率，这相当于一个体内的药敏试验。既往，人们通过细胞学或影像学的检查来进行评价并取得了较好的结果。但是，由于这些检查的先天不足使得其检测灵敏度较低。就白血病而言，传统的细胞学检查检出极限是10-2。所以，在传统形态学检查不能发现白血病细胞时，部分患者可能骨髓细胞中白血病细胞的比例不到10-5；但有些患者却可能高达10-2时体内的白血病细胞总量为105～108。体内残留的白血病细胞越多，复发的可能性越大。那么，同样是完全缓解的患者，由于他们体内白血病的残留量不同，他们复发的危险性也不相同。为了尽可能清除残留的白血病细胞，当前最容易想到或做到的是增加化疗强度。但是，这种盲目地提高化疗强度，虽然可以降低白血病的复发率，但同时也增加了治疗相关的不良反应，治疗相关死亡率的风险明显增加。而实际上很大一部分患者并不需要如此强烈的化疗。如何来甄别哪一部分患者因为残留较多的肿瘤细胞，需要更加强烈的化疗，甚至造血干细胞移植，这是避免过度治疗的关键。我们唯一能做到的就是增加白血病或肿瘤克隆的检出敏感性和特异性。我们把经过治疗后机体内残留的不被常规细胞学检测发现的少量肿瘤细胞称为微小残留病（MRD）。通过MRD的监测我们可以更加准确地评价治疗对肿瘤的杀伤作用，动态地区分肿瘤患者的预后风险。

另一方面，通过MRD监测可以早期预报肿瘤复发。肿瘤患者在经过治疗后可获得缓解，但停止化疗或肿瘤细胞发生原发或继发耐药后，体内残留白血病细胞克隆将不断增殖，再次出现白血病临床表现，即复发。人们发现在患儿复发前即使骨髓原始细胞＜5%，MRD监测也可发现肿瘤细胞的异常增殖，表现为持续阳性或负荷逐渐增多。定期检测MRD有助于早期发现可疑病例并给予早期干预治疗，从而延长患者CR期和长期存活率。

再者，通过MRD监测可以区别白血病细胞和正常幼稚细胞。在白血病化疗后的骨髓恢复期可以出现较多的幼稚细胞，有时可以超过5%（图4-7）。若以形态学标准即可判为复发。但是如果进行短期随访，我们可以发现这些患者的幼稚细胞可以重新恢复到正常。如果通过MRD监测可以很容易地鉴别正常幼稚细胞和白血病细胞。

最后，几乎所有的肿瘤复发均起源于MRD，这是10%～30%的白血病患儿因疾病复发而导致治疗失败的根源，也是其他肿瘤复发的祸根。针对MRD的治疗有助于恶性肿瘤最终预后的改善；而发现MRD是最终治疗MRD的首要条件。

图4-7　白血病细胞（左）和骨髓抑制恢复期骨髓象（右）比较（见书末彩图）

一、急性淋巴细胞白血病的微小残留病的监测

MRD的监测实际上是在大量正常细胞中检出少量的肿瘤细胞，归根结底是发现肿瘤细胞的特异性标志。在ALL中可以用于MRD监测的特异性标志为特异性融合基因，如t（17；19）、t（1；19）、t（11；14）、t（4；11）、t（9；22）等。它们引起白血病的分子机制也是白血病细胞特异的分子标志，对其检出可以代表白血病细胞的残留。由于基因断裂点的融合的随机性及内含子的存在，基因组DNA水平融合变化很大，只能通过原位荧光杂交方法（FISH）进行检测。或者通过检测它们的转录本，常用的方法是反转录PCR。但由于其分布仅限于少数特殊的白血病类型，且必须得到相应融合基因的特异序列等，因此并不能作为广泛的MRD检测指标。

免疫球蛋白基因和T细胞受体（TCR）的重排（图4-8）：在淋巴细胞的胚系发育过程中免疫球蛋白基因和T细胞受体基因均须经过基因选择、拼接等重排过程形成成熟B淋巴细胞免疫球蛋白可变区的多样性和T细胞的TCR可变区的多样性。每一种重排方式几乎都是唯一的，所以在用PCR检测时只能得到涂抹条带或根本扩增不出阳性的条带。但是，在淋巴细胞白血病细胞中由于其单克隆性，所有白血病细胞都拥有同样的重排方式。在用PCR进行检测时，可以在电泳时呈单一条带；如果根据每一例患者设计不同的引物和探针可以特异地检出白血病克隆。在ALL，IgH和（或）TCR基因重排的发生率很高，约98%的B-ALL有IgH基因重排；而T-ALL中，约有91%具有TCRγ基因重排，96%具有TCRδ基因重排，89%TCRβ基因重排。

1．基因的异常表达 在正常骨髓细胞和外周血细胞中WT1的表达极低，甚至无法被PCR技术检测到，但在急性白血病细胞中往往有较高的表达。所以也有人试图用它来作为MRD的标志。但是WT1作为MRD标志的敏感性和特异性均不是太理想，而且在ALL中有细胞免疫标记、免疫球蛋白基因重排标记及融合基因标记等特异性和敏感性均很高的MRD标记，它们的综合应用可以覆盖绝大多数病例。所以WT1的表达很少被用作ALL的MRD标记。

2．细胞免疫标记的异常（LAIP） 人类血细胞的分化与发育来自于造血干细胞（HSC），从HSC分化至各种成熟血细胞成分是一个复杂的过程。HSC在多种生长因子驱动下，向各

图4-8　淋巴细胞胚系发育过程的基因重排

个造血细胞系列分化，并会出现特定的分化抗原。正常情况下，这些抗原具有阶段特异性和特定的表达顺序或规律，如CD34仅在造血干／祖细胞上表达而不在较成熟的血细胞上表达；CD3、CD20、CD11b、CD15、GP-A、CD41等仅在较成熟的T细胞、B细胞、髓细胞、红细胞及巨核细胞上表达，而不在幼稚的HSC上表达；CD45在所有白细胞上表达等。与正常造血细胞相比，白血病细胞上的这种分化抗原表达规律遭到破坏，出现白血病细胞相关性表型特征，主要表现有：①血细胞分化成熟过程中正常表达的抗原缺失或表达过度，如B细胞系急性淋巴细胞性白血病CD45的表达缺失或T-ALL时CD34、末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT）的表达过度等；②淋巴系和髓系相关抗原共表达，如CD22、CD33的共表达等；③不成熟和成熟抗原的非生理性共表达，如CD34、CD56的共表达；④细胞表面和细胞质内抗原同时表达，如TALL的细胞膜（m）CD7／细胞质；⑤CD3、B-ALL的mCD19／cCD22等。表4-5为常见的ALL异常免疫表型组合及其发生频率。

表4-5　ALL MRD检测免疫表型组合

根据目前国际上急性淋巴细胞性白血病（ALL）治疗各阶段微小残留病（MRD）评估的研究进展，MRD高水平对预后的影响已得到公认，检测的主要方法为流式细胞仪免疫表型组合特征检测、特殊融合基因标记PCR定量检测和ALL的免疫球蛋白或T细胞受体基因重排PCR检测，敏感性均可达到10-4。多个国际著名儿童白血病研究中心的结果提示，在诱导治疗早期、诱导治疗结束时、3个月或更晚，MRD高水平与预后高度相关，并因此将治疗早期MRD评估作为分层治疗强度选择的一个必要标准，在诱导结束时及以后，多数以10-4为判断值。

二、急性髓细胞白血病的微小残留病监测

AML中可以用于残留病并监测的特异性标志如下。

1．特异性融合基因 PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-ENL、MLL-ELL等融合基因直接和AML的发病有关，它们不但是影响预后的重要因素，同时又是MRD的特异标志。虽然也有报道在正常人中也可以表达少量的融合基因，但基本不影响它们对疾病状态的评价。但融合基因作为MRD标记的最大缺陷是其较窄的覆盖面。目前任何一种融合基因的发生率均不超过10%，而且所有可以发现融合基因或细胞遗传学异常的AML占所有AML病例的1／2左右。这种覆盖范围的缺陷限制了它在AML微小残留病灶检测中的应用。

2．AML相关的基因突变 除了上述的融合基因，近年来发现许多基因突变在AML的发病环节中起着重要作用，而且对AML预后发生重要的影响。目前，备受关注的基因突变有MLL-PTD、FLT3-ITD、NPM1和CEBPA。尤其是FLT3-ITD和NPM1突变，分别预示不良预后和良好预后，在成年人AML中发生率高达25%，在细胞遗传学正常的AML中发生率高达40%～60%。但文献报道，儿童AML的发生率较低，其中NPM1突变的发生率不及10%。最近，我们在中国儿童AML的研究数据显示，NPM1突变的发生率高达近40%，FLT3-ITD可以在1／3的儿童AML中发现。所以就其覆盖面来说，这些基因是AML残留病灶的较好的分子标记。我们结合PLM／RARA、AML1／ETO和MLL-PTD、FLT3-ITD、NPM1，发现超过3／4的AML可以有至少一种分子事件。但是，如果要将这些基因突变作为MRD的标志尚需考虑两个问题：①突变的稳定性，即在白血病治疗过程中这些基因组的改变是否始终保持不变。近来的研究显示，NPM1和CEBPA突变的稳定性很好，居大多数病例在白血病复发时其分子改变和初发时相同，这种符合率均在90%以上。但FLT3-ITD的稳定性在各组研究中的结果不尽相同，复发前后的符合率为80%～95%，但仍然不失为一种有用的MRD标记。②突变的多样性，所有这些基因突变的类型及发生位点变异较大，尤其是CEBPA的突变热点较为分散，很难用一种通用的方法来检出每一个基因的所有突变。

3．基因的异常表达 最常用于AML残留病灶检出的基因表达异常是WT1，此外有EV1、PRAME等。它们在AML中的覆盖率各不相同，但据研究显示，它们的稳定性非常好。AML常见的异常分子标记及发生频率（表4-6）。

4．细胞免疫标记的异常 与ALL相似，AML同样利用LAIP，这些LAIP可分为4大类（表4-7）：①交叉系表达抗原；②抗原高表达；③抗原表达缺失；④抗原不同步表达。

表4-6　AML常见的异常分子标记及其频率

表4-7　AML相关免疫标型组合分类

“＋＋”．过表达；“＋”．表达；“-”．不表达

AML的LAIP更为复杂，这是由于AML患者个体之间表型存在高度异质性，有些病例所有白血病细胞可能都可以归于一类LAIP，但其他病例则可能仅部分白血病细胞可以归于同一类LAIP。白血病细胞是否能归于同一类LAIP取决于与正常骨髓细胞相比，其LAIP异常程度。因此对于缺乏可供选择的LAIP组合的AML患者，其原因可能为：①仅部分细胞可以归于某一LAIP；②所有白血病细胞均能归于同一LAIP，但由于与正常细胞免疫表型重叠而缺乏敏感性和特异性；③缺乏可供MRD监测的异常免疫表型。早期的研究显示，成人AML的MRD覆盖率在75%左右，儿童AML的覆盖率在85%左右。最近的报道显示，可用于儿童AML的MRD诊断的LAIP可以高达90%以上。但是由于许多AML的LAIP和正常细胞的表型差别较小，MRD阳性标准除个别组合可达0．01%外，大多以0．1%（10-3）作为阳性标准。此外，对AML患者做MRD检测时，其LAIP可能会因为治疗等因素影响发生改变，从而失去对复发预测的意义，使其对疾病预后判断的价值受到限制。

三、实体瘤的微小残留病灶

实体瘤的MRD可以有两层意义。一是实体瘤块病灶的残留，二是肿瘤细胞的骨髓浸润，后者也可称为微小浸润。前者主要依靠影像学检查和肿瘤残留的病理检查，后者主要利用肿瘤细胞特异的异常标志。

1．淋巴瘤的骨髓微小浸润 淋巴瘤的分期是淋巴瘤预后评价的主要指标也是治疗方案选择的基础，而骨髓浸润是淋巴瘤分期的最主要指标之一。当淋巴瘤发生骨髓浸润时其微小病灶检测的基本原理和方法与ALL相似。

2．神经母细胞瘤

（1）基因组异常及基因的异常表达：与血液淋巴系统肿瘤不同，至今人们尚没有明确发现具有高覆盖率的可以作为神经母细胞瘤微小残留病监测的融合基因和异常表达基因。

（2）特异表达的免疫标记：通过多方研究，在NB-MRD监测研究中两种抗原备受关注，即双唾液酸神经节苷脂（GD2）和CD45／CD56／CD81组合。前者只在大部分神经母细胞中表达，而且只在未分化的肿瘤细胞中有强烈的表达，一旦肿瘤细胞发生分化其表达也就逐渐消失。GD2也同时表达于黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞、横纹肌肉瘤细胞和骨肉瘤细胞上。但GD2不在造血细胞中表达，所以理论上GD2的特异单抗非常适合于骨髓中神经母细胞瘤的MRD。但是由于GD2以随着肿瘤细胞的分化发生抗原消退所以可以造成检测的假阴性，不过这种假阴性发生在分化的肿瘤细胞上，其临床意义相对较小。另一方面，GD2可以从神经母细胞上脱落，脱落在血浆中的可溶性抗原可以被骨髓中的巨噬细胞吞噬或者非特异地吸附到造血细胞表面造成假阳性。CD45／CD56／CD81组合中，CD81是细胞信号复合物的组成部分，广泛分布于大多数的淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞表面，但中性粒细胞、血小板不表达CD81，而人类NB细胞株也表达CD81。CD56是一种神经细胞黏附分子，适度表达于PB大颗粒淋巴细胞的亚群上及所有以NK细胞激活的细胞，人类NB细胞株可表达该神经细胞黏附分子。CD45是白细胞共同抗原，所有造血细胞均表达，但人类NB细胞株不表达。因此选择不表达CD45，而表达CD81和CD56（CD45-FITC／CD81-PE／CD56-PECy5单抗组合）可除外淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、NK细胞等血细胞，而明确为表达CD81和CD56的神经元细胞，在儿童中主要为神经母细胞瘤细胞，适合于作为骨髓微量肿瘤浸润的监测。目前尚不明确该组合是否也适合于原始神经外胚叶性肿瘤（PNET）。