双重染色技术

应用免疫组织化学的方法在同一张组织切片或细胞涂片上同时或先后标记出两种或两种以上的抗原成分，并同时进行观察，即为双重或多重免疫染色。光镜下可通过标记物或其反应生成物的颜色不同分别标记不同抗原成分，电镜下则可通过标记物颗粒的大小或反应产物电子密度不同来标记不同的抗原成分。这样可以对同一切片不同细胞、同一细胞内或亚细胞结构内不同抗原的成分进行定性、定量和定位研究，并以此来研究它们之间的相互作用关系。

实验过程中，所用抗体试剂可为异种动物，也可为同种动物。异种动物抗体常混合使用，操作步骤少，脱片率相对低，同种动物一般需要分别使用，操作步骤加倍，脱片率相对高，相互交叉重叠机会大。

（一）双重免疫荧光染色

在对同一细胞或组织标本上需要检测两种抗原时，可进行双重荧光染色。采用不同颜色的荧光素分别标记不同的抗体，原则上是尽量减少不同荧光物质间激发／发射光谱的重叠。可以采用直接法或间接法，直接法特异性高、快速；间接法敏感性高，目前较常用。

【基本原理】　双重免疫荧光即是将两种特异性抗体（例如抗A和抗B）分别以发出不同颜色的荧光素进行标记，最常采用异硫氰酸荧光素和四甲基异硫氰酸罗丹明标记的抗体。其中抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记发出黄绿色荧光，抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗丹明标记发出橙红色荧光，将两种荧光抗体按适当比例混合后，按照直接法或间接法与细胞或组织上的抗原反应。发出黄绿色荧光的即抗A抗体结合部位，发出橙红色荧光的即抗B抗体结合的部位，这样就能在同一张切片中显示出两种抗原。

【制作要求】　免疫荧光标本制作要求如下。

（1）载玻片厚度应在0．6～1．2mm。

（2）盖玻片应光洁。

（3）标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部。

（二）双重免疫酶标记染色

【基本原理】　以酶催化不同底物呈现不同颜色产物以此来标记同一切片内两种抗原，在光镜下可以同时观察对比。直接法、间接法、酶桥法均可使用，灵敏度以酶桥法中的PAP复合物法最高，特异性则以直接法最佳。

【常用方法】

1．免疫酶标记法与免疫荧光标记法相结合染色法　该法适用于两种抗原分布于不同细胞内，而且一种抗原浓度高、反应强。

2．同一切片的再度染色法　常用于神经递质、神经肽的研究，该法第一种抗原用4－氯－1－萘酚（CN）染色，摄影，然后利用CN在乙醇内可溶、酸处理可以使抗原抗体解离的性质，先用低pH的甘氨酸／盐酸缓冲液孵育切片除去第一种抗体，而后梯度乙醇脱CN色，PBS洗净后，进行第二种抗原染色，DAB显色，再次摄影进行比较研究。

3．同一切片、不同呈色的双重染色　第一种抗原DAB／H2O2呈色，终产物为棕褐色；第二种抗原CN／H2O2呈色，终产物为深蓝色，光镜下可同时进行观察。该法DAB与CN色彩对比不鲜明，而且可能出现混合颜色。

4．两种酶标抗体的双重染色　分别用HRP和ALP标记间接抗体，免疫组化染色，HRP标记抗体DAB／H2O2呈色底物为棕褐色，ALP标记抗体坚固红（fast　red）呈色底物为玫瑰红色。

5．不同种属的来源的酶标抗体双重染色　上述的双重染色法，均系来自同一种属特异抗体和相同／不同的酶标抗体，所以两次染色间常有交叉反应。如果采用不同种属的特异性抗体和两种酶标抗体，例如显示A抗原为小鼠单克隆抗体，二抗为ALP标记兔抗小鼠IgG；显示B抗原为豚鼠单克隆抗体，二抗为生物素化羊抗豚鼠IgG，HRP显色，能够显著降低抗体之间交叉反应。

【染色步骤】　不同种属来源的酶标抗体双重染色步骤如下。

（1）常规切片准备同间接法。

（2）切片加入A特异性抗体（如小鼠单克隆抗体），4℃过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5min。

（3）滴加ALP标记二抗（兔抗小鼠IgG），37℃，30min，PBS冲洗3次，每次5min。

（4）滴加链霉菌抗生物素蛋白－碱性磷酸酶，室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min。

（5）碱性磷酸酶显色液（BCIP／NBT）显色（紫蓝色），PBS冲洗3次，每次5min。

（6）滴加0．05%盐酸，室温10min（可避免已显色的抗原褪色）。

（7）滴加非免疫血清，37℃孵育10min。

（8）切片加入B特异性抗体（如豚鼠单克隆抗体），4℃过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5min。

（9）滴加生物素化二抗（羊抗豚鼠IgG），37℃，30min，PBS冲洗3次，每次5min。

（10）滴加链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶，室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min。

（11）过氧化物酶显色液（AEC）显色（鲜红色），PBS冲洗3次，每次5min。

（12）苏木素复染细胞核。

（13）水溶性封片剂封片。

【注意事项】

（1）标记染色的顺序需按组织标记抗原的性质，含量少、脆弱先标记；含量大、耐受后标记。

（2）严格操作步骤，洗涤需彻底。

（3）一般多采用水性封片剂，如50%缓冲甘油。