染色结果判定

免疫组织化学染色中影响抗原、抗体和免疫反应的因素很多，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果。从染色的结果看，出现的问题可分为无色片和“杂音”染色片。出现无色片的原因可能是整个染色过程没有出现问题，而是组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原，或是染色过程中的某一或某些环节出了问题。

【影响因素】　出现“杂音”片可能的原因如下。

（1）抗体浓度过高。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高。

（3）DAB变质和显色时间太长。

（4）组织液体流失变干。

（5）切片在缓冲液、修复液、二甲苯中浸泡时间太长。

（6）切片边缘着色。

（7）试剂仅覆盖了部分组织。

（8）内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、自发荧光等物质的存在。

【判定方法】　在进行免疫组化染色时，必须证实组织内显示的反应产物，确实是抗原与相应的特异性抗体反应所产生的。因此，对免疫组织化学染色结果的评价必须设置对照组才能做出正确的判断。常用判定方法如下。

1．阳性对照　是用已证实含有待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性。每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染色过程中各个步骤以及所用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。特别是当待检的标本为阴性结果时，必须设置阳性对照。

2．阴性对照　是用确知不存在待检抗原的组织切片染色，应呈阴性结果，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的“假阳性”结果。

3．空白对照　是用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一抗，染色结果应为阴性，可排除组织的内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、自发荧光等物质引起的非特异性显色。

4．自身对照　是用同一组织切片上与待检抗原无关的其他结构做对照，如上皮组织与间叶组织，平滑肌与神经纤维。阴性反应与阴性结构同在一个视野中，相互印证。但科研工作中，单纯自身对照是不科学的，必须增加空白对照、阴性对照、阳性对照或Western　blotting对相应蛋白质进行检测来加以证实。

【注意事项】　对免疫组织化学染色结果的判断应持科学的慎重态度，必须学会判断特异性染色和非特异性染色，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，除有对照试验结果之外，应进行多次重复试验，最好用几种其他方法进行验证，如用SP法阳性，可再用ABC法、PCR等验证。