探针的标记物

一个理想的探针标记物应具备高灵敏度、标记方法简单、标记不影响标记物原有活性、标记不影响碱基配对特异性；标记物检测方法简便、快速、准确、无害；标记探针具有较高稳定性，可保存一定时间，以便使用。探针的常用标记物可分为放射性核素和非放射性标记物两大类。

放射性核素标记探针应用较早，其原理是在杂交后以感光乳胶涂片，曝光一定时间后经显影以显示靶核酸的存在。常用的放射性核素标记物包括3　H、35S、32P、14　C、125I等。放射性核素标记探针的特点是灵敏度高，检测特异性好，但曝光时间要求较长，且有半衰期限制及放射性污染的危险性，对实验室的要求较高，一般不适用于普通实验室和日常检验工作。由于放射性核素标记探针使用过程中存在着上述诸多缺点，多年来学者们一直致力于寻找安全可靠、灵敏度高的标记物以替代放射性核素并取得了很大的进展。目前在原位杂交技术中，非放射性标记物的应用越来越多。常见的有荧光素、生物素和地高辛等，尽管其灵敏度和特异性不如放射性核素，但因其具有细胞定位较好、性能稳定、操作简便、成本低和耗时短、对实验室也无特殊要求等长处，其很快被广泛应用于探针的标记。常用的非放射性标记物主要有以下三种。

1．荧光素　如FITC、罗丹明等，标记探针可用直接法进行原位杂交，如荧光原位杂交（FISH）。该标记物特点为：操作需时短、方法简便、干扰因素少，多用于新鲜或冷冻组织、细胞和染色体的原位杂交检测。缺点是：该标记探针敏感性较低；无论是自己用荧光素标记探针或直接购买成品荧光素标记探针，探针成本均较高；杂交结果必须及时观察、照相或计算机采集图像，对相关设备条件的要求也高。由于FITC是半抗原，也可连接酶标的抗FITC抗体，经酶－底物作用，在光学显微镜下观察结果。

2．生物素　应用较早，标记方法简单，有现成的药盒供应，杂交后可用酶标的抗生物素抗体或卵白素－生物素－酶来显示靶核酸。生物素作为探针标记物所遇到的最大问题是在人类的某些组织中存在内源性生物素，尤其是肝组织，其次是肾组织，在这些组织中使用生物素标记探针，会产生较强的背景着色，影响杂交信号的观察，因此一般不主张使用，这在很大程度上限制了生物素的应用。

3．地高辛　灵敏度和放射性核素标记的探针相仿，杂交后的切片背景好，细胞定位准确，而且在人类和多种动物的组织中不存在类似的物质，可以说是当前最佳的非放射性探针标记物。由于它也是半抗原，故与FITC标记探针的使用相似，可连接酶标的抗地高辛抗体，经酶－底物作用，在光学显微镜下观察结果。