长片段的技术

传统的PCR（标准PCR）通常只能扩增2～3kb以内的短片段，对5kb以上的长片段很难有效扩增。限制其扩增长片段的主要原因是：①因Taq　DNA聚合酶缺少3＇→5＇核酸外切酶活性，有较高的错误掺入率，而合成4．1kb核苷酸可能导致1次框码移位，在产物链3＇端出现错配碱基，促使链合成提前终止；②Tris缓冲液在温度升高时，pH降低，诱发脱嘌呤反应，使模板受损，导致长片段无法合成；③Taq　DNA聚合酶在PCR过程中活力下降；④非特异性扩增干扰长片段的延伸。近年来发展起来的长片段PCR（long　PCR）技术，针对上述限制因素将PCR反应体系进行了改良。已从人类基因组和λ噬菌体DNA中，成功地扩增出29．9kb和42kbDNA片段，有望成为一项实验室的常规方法。

1．模板　采用琼脂糖包埋细胞抽提法，获取高质量的模板DNA，以保证模板的完整性。

2．引物　应设计较长的引物，一般为21～34个核苷酸，可以使用较高的退火温度，减少错误引发，两个引物的解链温度应平衡，差别最好不要超过1℃。

3．酶　具有3＇→5＇外切酶活性（校正阅读功能）的DNA聚合酶可纠正复制时的错配，有利于长片段的延伸，但也存在破坏引物和单链模板的可能性。改良的方法是将无3＇→5＇外切酶活性的DNA聚合酶（如rTth）和低浓度有3＇→5＇外切酶活性的DNA聚合酶（如Pfu）组合使用。近来已采用酶的不同组合方式，实现了多种目的DNA的长片段扩增。其中以rTth与vent或Pfu组合效果最好，能够扩增出＞5kb的DNA片段。

4．缓冲液　长片段PCR反应体系通过提高Tris的浓度，或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力，并上调体系的pH，起始控制在pH　8．8～9．2，使随温度上升而降低的pH得到补偿。另外，在体系中加入一定量的甘油、EDTA、Tween20、聚乙二醇、DMSO、明胶等，以降低模板解链温度和（或）提高DNA聚合酶的稳定性，从而促进长片段的扩增。

5．热循环参数　增加延伸时间，一般为1kb／min。提高退火温度，同时采用热启动，以减少引物错配及引物二聚体的形成，增加扩增的特异性和产物量。热循环后期，每个循环适当增加延伸阶段的时间，如在28～40个循环的后12～20个循环中，每次增加15～30s，以保证产物链充分延伸。