药用植物种子种苗质量检测

【目的要求】　优良种子种苗是获得高产、优质药材的重要物质材料。药用植物栽培过程中，通常要求种子纯净一致、种子活力高、饱满完整、健康无病虫；种苗生长健壮、根系发达、生命力旺盛、芽健壮饱满、无病虫和机械损伤、栽植成活率高等。药用植物种子种苗质量的优劣，只有通过种子种苗检验后才能正确评价。所谓种子种苗检验就是应用科学的方法对种子种苗质量进行细致的检验、分析、鉴定，以判断其优劣的一种方法。种子种苗质量的检验对科学合理地播种以及安全贮藏等均有重要意义。种子检验分为田间检验和室内检验。田间检验是在药用植物生育期间，到野外或田间取样分析鉴定，主要是检查种子真实性和品种纯度，其次是检查杂草、病虫感染程度和生育情况等。室内检验主要是种子收获脱粒后，到现场或库房中扦取种子样品进行检验，检查项目包括种子真实性、净度、发芽率、千粒重、水分等。本实验主要进行种子室内检验。种苗检验主要是在药用植物苗床取样，检测其苗高、根茎比、根系活力、品种真实性等指标。本实验主要目的是让学生学习和掌握种子室内检验技术以及计算种子用价的方法等，同时了解并掌握种苗质量标准及基本的检测方法。

【实验原理】　药用植物种子具有一定的数量，种子检验对种粒往往具有破坏性，不可能也没有必要进行完全试验，所以要进行扦样。扦样就是从大量种子中扦取少量有代表性的样品检验用。鉴于一批种子中各个个体间存在差异，且不可能在群体中呈均匀分布，因此必须根据随机的原则，按照一定的程序进行抽样，以保证所抽样品与拟检验样品具有相同的组成和比例。

药用植物种子室内检验主要包括种子净度、千粒重、水分、发芽率、生活力等指标。其中，种子净度是指样品中去掉杂质和废种子后留下的好种子的质量占样品总质量的百分率。种子质量可用千粒重或容重表示。通常使用千粒重，即气干状态下1　000粒纯净种子的质量（大种子和测定百粒重）。千粒重能反映种粒的大小和饱满程度，质量越大，说明种粒越饱满，内部含有的营养物质越多。种子含水量是指种子所含水分的质量占种子质量的百分率，一般用105℃恒重法和130℃高温快速法。种子发芽率是指发芽试验终期或规定日期内，全部发芽种子数占供试种子数的百分率。发芽率高，表示有生活力的种子多，播种后出苗数多。种子发芽势是指发芽试验初期，规定日期内正常发芽的种子数占供试种子数的百分率。发芽势高，表示种子生活力强，发芽整齐，出苗一致。种子生活力是指种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。药用植物种子寿命长短各异，很多种子休眠期较长，为了在短期内了解种子的品质，用测定发芽率的方法显然行不通，一般采用生物化学的方法测定种子的生活力，以确定种子是否能用并估算播种量。测定种子生活力的生物化学方法有四唑（TTC）染色法、靛蓝染色法、碘－碘化钾染色法等。其中，以四唑染色法和靛蓝染色法应用较多，四唑染色法的原理是有生活力种子的胚细胞脱氢酶活性高，2，3，5－氯化三苯基四氮唑，简称四唑（TTC），接触到种子活性组织，被吸收的TTC参与了活细胞的还原作用，接受氢离子，被还原成红色、稳定、不能扩散的三苯基甲酯。无生活力的种子无此反应，由此根据胚组织是否被染色及染色的深浅和多少来判断种子的生活力的强弱。靛蓝［C16H8O2N2（SO3Na）2］是一种苯胺染料，其原理是根据活细胞原生质有选择渗透的能力，某些苯胺染料不能进入活细胞内部，因此不染色，而死细胞原生质无此能力故被染成蓝色。根据染色部位和染色面积的大小来判断种子生活力，一般染色所使用的靛蓝溶液的质量分数为0．05%～0．1%，宜随配随用。

药用植物种苗的数量往往也比较大，我们也只能抽样检测，检测所需种苗的数量往往与工作量、调查精度有密切关系。测量数目多精度高，但工作量大；测量数目少省工，但精度常达不到要求。为了减少工作量，通常在保证精度的前提下，以少量苗为宜。据经验，如移栽苗、扦条苗和密度均匀的播种苗（质量变动不大），一般量苗株数在60～100株质量精度能达到95%以上；质量不整齐的种苗，量苗株数要100～200株。

壮苗的形态指标为根系发达，有较多的侧根和须根，根系有一定长度；苗干粗而直，有粗度相称的高度，枝条充分木质化，枝叶繁茂，色泽正常，上下匀称；无病虫害和机械损伤；种苗根茎比值较小，高茎比值较小，而质量大。根据国家规定，在生产上用的种苗质量分级指标以苗高、地径和根系长度为主。苗高指苗自地表面量至顶芽基部的高度。地径指近地面处苗干直径，遇地际直径有瘤状物、庞大或不圆等现象时，测量自地面起到正常部位的直径。对有地上茎的苗木，还需测定胸径，即距地面1．3m处的苗干直径。高茎比是种苗高度与地际直径之比。它是反映苗高与粗的关系。比值适宜的种苗生长均匀，质量好。高茎比大的种苗细高，过小的种苗粗而矮，都不符合壮苗条件。茎根比指种苗地上部分鲜重与地下部分鲜重之比。正常生长的种苗，若茎根比值较小则说明其根系发达，种苗质量好。实际上，由于药用植物种类繁多，不同药用植物的优良种苗的质量标准不一，许多药用植物种苗质量标准正在拟定中。

种苗形态指标直观、易操作，生产上应用较多，但形态指标仅反映了种苗的外部特征，难以说明种苗内在生命力的强弱。根系活力是评价种苗质量的重要指标之一。因植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。

【实验材料与仪器用具】

1．实验材料　红花、决明子、牛蒡子或薏苡等袋装、散装种子；白芷、木通、杜仲、枇杷、黄檗等种苗。

2．仪器用具

（1）扦样分样：袋装扦样器（长柄短筒扦样器或圆筒形扦样器）、样品盘、样品袋（或筒）、钟鼎式分样器（或分样板）。

（2）种子净度检验：天平（感量0．01g）、尖嘴镊子，培养皿、谷物筛选和电动筛选器。

（3）种子发芽率检验：电热光照发芽箱或调湿调温箱或普通温箱、培养皿、尖嘴镊子、吸水纸（或滤纸）、标签纸牌。

（4）种子水分测定：电热恒温鼓风干燥箱、天平（感量0．01g）、铝盒（直径4．5cm，高2．5cm）、粉碎机（具1．0mm圆孔筛片）、广口瓶、坩埚钳、棉纱手套、角匙、干燥器（具干燥剂）。

（5）种子千粒重：数粒仪、天平（感量0．01g）、样品盘、镊子。

（6）种子生活力：培养皿、放大镜、烧杯、天平（感量0．01g）、量筒、镊子、刀片、吸水纸等。

（7）种苗质量检测：游标卡尺、钢卷尺、皮尺、天平（感量0．01g）。

（8）根系活力测定：分光光度计、天平（感量0．000　1g）、温箱、研钵、三角瓶50ml、漏斗、量筒100ml、吸量管10ml、刻度试管10ml、试管架、容量瓶10ml、药勺、石英砂适量、烧杯10ml、1 000ml。

3．试剂

（1）TTC溶液：为保持染色过程中染色液pH的稳定性，应使用缓冲溶液来配制四唑溶液，一般都使用磷酸缓冲液。用磷酸缓冲液配制成0．1%～1%的TTC溶液，并调溶液的pH至6．8～7．2，贮于棕色瓶内保存。

磷酸缓冲液的配制：

溶液Ⅰ：称取9．078g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶解于1　000ml蒸馏水中。

溶液Ⅱ：称取9．472g磷酸氢二钠溶解于1　000ml蒸馏水中。

按2∶3的比例取溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合即成缓冲液。

（2）靛蓝溶液：称取靛蓝1g，溶于1　000ml蒸馏水中，水温30～40℃，充分搅拌后，置于30～40℃恒温箱中，经12h后使其全部溶解，即得0．1%的染色液。

（3）乙酸乙酯（分析纯）。

（4）次硫酸钠（Na2S2O4）（分析纯）。

（5）磷酸缓冲液（1／15mol／L，pH7）。

（6）1mol／L硫酸：用量筒取密度1．84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1　000ml。

（7）0．4mol／L琥珀酸：称取琥珀酸4．72g，溶于水中，定容至100ml即成。

【实验内容与方法】

1．种子质量检测

（1）扦样和分样

①种子批的划分：同一来源、同一品种、同一年度、同一时期收获，质量基本一致，规定质量之内的种子划分为一个种子批。种子批的大小根据不同品种来确定，一般情况下种子批的最大质量10　000～40　000kg。

②扦取初次样品：初次样品的扦取，根据袋装或散装种子的不同分为袋装扦样法和散装扦样法，前者以扦样袋数作为标准（表2－7），而后者以扦样点数作为标准（表2－8）。袋装种子应随机选定取样的袋，从上、中、下各部位设扦样点，用合适的扦样器，根据扦样要求扦取样品；散装扦样时也应随机从各部位及深度扦样，每个部位扦取的数量应大体一致。

表2－7　袋装的扦样袋（容器）数

表2-8　散装的扦样点数

用合适的扦样器，根据扦样要求扦取初次样品。单管扦样器适用于扦取中小粒种子样品，扦样时用扦样器的尖端先拨开包装袋的线孔，再把凹槽向下，自袋角处尖端与水平30°向上倾斜地插入袋内，直至到达袋中心，把凹槽旋转向上，慢慢拔出，将样品装入容器中。双管扦样器适用于较大粒种子，使用时需对角插入袋内或容器中，在关闭状态插入，然后开启孔口，轻轻摇动，使扦样器完全装满，轻轻关闭，拔出，将样品装入容器中。使用长柄短筒圆锥形扦样器时，旋紧螺丝，再以30°的斜度插入种子堆，到达一定深度后，用力向上一拉，使活动塞离开进谷门，略微振动，使种子掉入，然后抽出扦样器。

③配制混合样：将同一检验单位各点所扦取的小样，经感官检验，如品质大体一致而无明显差异，即可经充分混合在一起，组成一个原始样品。一般混合样品不应小于送检样品的10倍。

④分样

a．机械分样器法：使用钟鼎式分样器时应先刷净，样品放入漏斗时应铺平，用手很快拨开活门，使样品迅速下落，再将两个盛接器的样品同时倒入漏斗，继续混合2～3次，然后取其中一个盛接器按上述方法继续分取，直至达到规定质量为止。使用横格式分样器时，先将种子均匀散布在倾倒盘内，然后沿漏斗长度等速倒入漏斗内。

b．四分法：将混合样品倒在光滑洁净的桌面上或玻璃板上，用分样板将样品先纵向混合，再横向混合，如此混合4～5次，然后将种子铺平成1cm厚的正方形，用分样板分两条对角线，即把种子分为4个三角形，取2个对顶三角形的，再混合铺平，继续分取，直到平均样品达所需要的质量为止。

（2）种子净度检验

①大型杂质的检验：对0．6cm以上的大型杂质，应取出称其质量，计算百分率，以后再与定量试样的杂质百分率合并计算全部杂质的百分率。

②净度测定样品的提取：大量的研究表明，大约2　500粒种子单位的质量在净度分析中是有代表性的。将收到的送检样品用四分法或小型分样器分样，直至规定的质量以保证净度测定后有足够量的纯净种子用于其他测定。不同质量样品的称量精度（表2－9）。净度分析可用规定质量的1份试样或两份半试样（试样重量的一半）进行分析。

表2－9　称重与精度

③试样筛选分析：试样用筛选机进行筛选，或用人工区分出纯净种子、废种子和夹杂物3种成分，并分别称重，称重精度同上。

④样品分析误差的检查：将测定样品的上述3个组成部分分别按前述称量精度称量，3部分质量之和与该样品原质量的差值如未超过表2－10所列容许误差范围，则误差检查合格，可根据测定结果计算净度。否则要重新测定。

表2－10　测定净度的容许误差

⑤净度计算

种子净度的计算公式如下：

种子净度（%）＝［试样质量－（大型杂质质量＋试样的全部杂质质量＋废种子质量）］×100／试样质量（式2－6）

（3）种子千粒重的检验：将净度检验后的纯净种子均匀混合，随机数取2份试样，每份1　000粒，然后称重。称量精度同净度测定。检验结果用2份试样原平均数表示。如两次重复之间的差异超过此平均数的5%，应重做。

（4）种子水分检验：本实验采用130℃60min快速烘干法，适用于种子不含挥发性油分的多数药用植物种子。对种子中含大量挥发性油分者则可用甲苯蒸馏法。

①试样和称量铝盒的准备：将装于密封容器内的平均样品，充分混合，从中取试样30～40g，除去杂质，用粉碎机粉碎，要求粉粒细度通过1．0mm圆孔筛（至少50%通过0．5mm筛，而留在1．0mm筛上的不超过10%）。并立即装入磨口瓶混匀备用。

把称量铝盒洗净，置于105℃烘箱烘干1h左右，取出放入干燥器内冷却，称重，记下盒重。

②首先将烘箱预热至140～145℃，然后把试样迅速放入烘箱内，关好门，约在10min内当温度回升到130℃时，开始计时。在130℃±2℃下烘60min，立即取出，放入干燥器内冷却，而后称重，计算水分。根据测定结果分别计算2份测定样品的含水量百分数，精确到小数点后1位。

2份样品测定结果差距不得超过0．5%，否则需重新测定。如第二次测定的差异不超过5%，按第二次结果计算水分含量。如第二次差异仍大于0．5%，则从4组中抽出差距小于5%的两个组，以其平均数作为测定结果。

（5）种子发芽试验

①数取试样：从净度检验后的好种子中随机数取试样4份，每份100粒，共400粒。

②置床：将供试种子消毒后整齐地排列在发芽床上（每皿100粒），粒与粒之间至少保持与种子同样大小的距离。置床完毕，加盖后放在25℃恒温发芽箱内发芽。发芽箱内应保持90%以上的相对湿度。

③检查管理：发芽期间需要每天检查发芽箱内的温度和发芽床的水分。如有发霉，应取出冲洗，必要时须调换发芽床；霉烂种子要除去并记载下来。同时要注意发芽箱及发芽皿的通风换气。

④发芽的检验和结果计算：检查记载时，可将符合发芽标准的正常幼苗和不正常的畸形苗分别记载，并将发芽的种子，从发芽床上取出。未达到正常发芽标准的种子，仍留在发芽床上，继续入箱培养。

种子发芽势和发芽率计算公式如下：

种子发芽势（%）＝发芽初期（规定日期内）正常发芽粒数×100／供试种子粒数（式2－7）

种子发芽率（%）＝发芽终期（规定日期内）正常发芽粒数×100／供试种子粒数（式2－8）

发芽势和发芽率以4次重复和平均数表示，计算至整数。4次结果与平均数之间允许有一定差距。发芽率允许差距（表2－11）。

表2－11　种子发芽率允许差距

4份试验的结果中有1份超过差距，则计算其余3份平均数。如有2份超过，应重做发芽试验。如仍有2份超过，则将两次8个试验结果平均计算。

（6）种子生活力测定

①TTC法：从纯净种子中随机抽取50～100粒种子，4个重复。一般将种子在水中浸泡16～24h，待种皮软化后，沿种脊小心地通过胚中心将种子切成两瓣，放入烧杯或培养皿内，切面朝下，注入TTC溶液，浸没剖面，放入25～30℃温箱内染色2～3h。经过染色的种子取出后，用清水冲洗净，放在白色滤纸上，逐粒观察胚和胚乳的染色情况。有生活力种子胚被染成红色，无生活力种子则不染色或仅有浅红色斑点。

②靛蓝染色法：其取样和染色步骤与TTC法基本一致。但是在染色时必须注意，种子染色后，要立即进行观察，以免褪色。凡胚未染色者为无生活力的种子，凡种胚或子叶染成斑点状的为生活力弱的种子。

生活力的百分率根据4个重复计算，不带小数，重复间最大容许误差与发芽测定的规定相同。最后以4组生活力百分率的平均值代表该批种子的生活力。

（7）种子用价：种子用价是指种子样品中真正有利用价值的种子所占的百分率。其计算公式为：

种子用价（%）＝种子净度×种子发芽率／100（式2－9）

2．种苗质量检测

（1）取样方法：采用样地法，具体在苗床中主要采用机械抽样法和随机抽样法。机械抽样法即先随机确定起始点，然后以等距离均匀分布各样地；随机抽样法是自始至终利用随机数表决定样地的位置。样地的大小根据苗木的大小和株行距决定，一般为1m2或100m2；至于样地的数量，根据数理统计理论以及调查经验，一般初设样地20～50个能达到产量精度90%、质量精度95%的要求。

（2）形态指标考察：对取回的样品，逐株考察地径（胸径）、苗高、病虫害情况、地上鲜重、地下鲜重等形态指标。

（3）根系生长活力

①TTC标准曲线的制作：取0．4%TTC溶液0．2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0．25ml、0．50ml、1．00ml、1．50ml、2．00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF 25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

②称取根尖样品0．5g，放入10ml烧杯中，加入0．4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol／L硫酸2ml，以停止反应。与此同时做一个空白试验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上。

③把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出TTF。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。

④结果计算

四氮唑还原强度［mg／（g·h）］＝四氮唑还原量（mg）／［根解重（g）×时间（h）］（式2－10）

【注意事项】

1．净度检验时注意纯净种子、废种子以及夹杂物的区分。所谓纯净种子是指完整的、未受伤的、发育正常的种子，发育虽不完全（例如瘦小、皱缩）但无法断定其为空粒的种子，虽已裂口或发芽但仍具有发芽能力的种子。废种子指能明显识别的空粒、腐坏粒，已萌发并显然丧失发芽能力的种子；严重损伤的种子和无种皮的裸粒种子。夹杂物指不属于被检验和其他植物的种子，如枝、叶、鳞片、果皮、苞片、种子碎片、石粒、土块、已脱离种子的种翅或其碎片以及其他杂质，昆虫的卵块、成虫、幼虫和蛹等。

2．采用TTC法判断种子有无生活力，主要看染色部位及大小，而不一定在于颜色深浅。另外，配制TTC溶液时，用蒸馏水也可，但为保持染色过程中染色液pH的稳定性，最好使用磷酸缓冲溶液配制。

【思考题】

1．根据实验结果填写下表（表2－12、表2－13）。

2．对某批种子进行抽样检验时，为什么要从容器的各个部位抽取初次样品？

3．为什么一批种子的送检样品量必须要求一定的数量？

4．用本实验的方法测定种子含水量，对测试样品有什么要求？

5．四唑法的染色原理与靛蓝法有何异同？

6．为什么要测定根系活力，植物的根与地上部分有何关系？

表2－12　种子检验结果单　　　　　　　　字第　　　号

检验单位：（盖章）检验日期：　　年　　月　　日

表2－13　种苗检验结果单　　　　　　　　　字第　　　号

检验单位：（盖章）检验日期：　　年　　月　　日