发现先导化合物

先导化合物（leading compound），也称新化学实体（new chemical entity，NCE），是指通过各种途径和方法得到的具有某种生物活性或药理活性的化合物。因为目前的知识还不足以渊博到以足够的受体机制指导药物设计以使药物的合成不必使用预先已知的模型，所以，先导化合物的发现，一方面有赖于以上两步所确定的受体和模型，另一方面也成了整个药物研发的关键步骤。一般来说，先导化合物主要有如下几个来源：对天然活性物质的挖掘、现有药物不良作用的改进以及药物合成中间体的筛选等。目前，主要有两个获得新的先导化合物的途径。一是广泛筛选，这种毫无依据的方法在实际操作上其实是比较有效的。过去半个多世纪以来，由于这个原因，先导化合物的发现随机性很强，如从煤焦油中分离出的被发现具有抗菌作用因而被开发成为一系列诸如萨罗的抗生素；又如对染料中间体的筛选发现了苯胺以及乙酰苯胺具有解热镇痛作用，经改造得到了非那西丁和乙酰氨基酚等。近20年来，计算机预筛被用于这一过程，大大加快了研究进程。另外，先导化合物的合理设计近年来也越来越成为这一领域的热点。所谓合理设计，是指根据已知的受体（或受体未知但有一系列配体的构效关系数据）进行有针对性的先导化合物设计，这种方法有别于一般普遍筛选的显著特点在于目的性强，有利于各种构效理论的进一步发展，因此前途十分广阔。

（一）天然活性物质

在19世纪至20世纪期间，从植物中提取、分离得到了许多有特殊治疗作用的药物。这些药物不需修饰，可直接应用于临床，是这一时期药物的主要组成部分。这些药物包括：吗啡（morphine）、阿托品（atropine）、东莨菪碱（hyoscine）、奎宁（quinine）、睾酮（testosterone）、雌二醇（estradiol）、紫杉醇（taxol）、苔藓抑素1（bryostatin）等。不仅如此，历史上还有许多药物以从动植物中提取的物质为先导化合物，然后进行结构修饰，获得了很好的结果。这些药物中较典型的有：以从菊科植物黄花蒿（artermisia annula）中分离的活性成分青蒿素（artermisinin）为先导物，经优化获得了二氢青蒿素（dihydroartermisinin）、蒿甲醚（artemether）和青蒿琥酯（artesunate）；以从喜树中分离出的喜树碱（camptothecin）为先导物，优化得到的伊立替康（irinotecan）和拓扑替康（topotecan）等。近年来，随着先进技术广泛对应用于天然活性成分的分离、提取及鉴定，活性天然物的发现及对其进行结构优化而开发新药变得更为快捷，因而从动植物中发现和提取新的先导化合物仍然是开发新药的重要途径。如从植物石杉中分离得到的石杉碱甲（huperzine A）是强乙酰胆碱酶抑制药；从番荔枝科植物中分离得到的内酯化合物（uvarcin）也具有广泛的抗肿瘤作用。

自20世纪40年代从青真菌中发现得到青霉素以来，人们逐渐意识到细菌和真菌的分离产物可以当做抗生素使用。后来，多种具有抗菌活性的天然抗生素被分离出来，如四环素、链霉素、氯霉素、红霉素等。但在进一步的实验中，这些抗生素的药效学和药代动力学性质出现了不尽如人意的问题从而限制了临床使用。这一时期，对天然菌类提取物的优化蓬勃发展，创制了100余种抗生素，包括后来在临床中得以广泛应用的阿莫西林（amoxicillin）、头孢哌酮（cefoperazone）和阿奇霉素（azithromycin）等。其间，大量的非抗生素类药物也从这类先导物中被提取或优化出来，包括从橘青霉素中提取得到的酶抑制药羟甲基戊二酰辅酶A（HMGCoA）还原酶抑制药美伐他汀（mevastatin）、从蒜曲霉菌属中得到的非肽类胆囊收缩素拮抗药阿司普尼辛（asperlicin）以及由此优化得到的地伐西匹（devazepide）。

还有一类天然活性物质是先导物的重要来源，即内源性生物活性物质，也就是人类或哺乳动物体内天然存在的具有生理功能和生物活性的物质。这类物质多由肽、蛋白质、糖类和小分子组成。随着生命科学的发展，大量的体内微量生理活性物质被发现，如小分子内源性物质及其受体和调节其含量的相应酶类、活性多肽和蛋白质及其受体等内源性活性物质。开发和应用体内这些微量的内源性物质为先导化合物寻找新药是目前新兴的领域。如下丘脑分泌的调节激素中，促黄体释放激素（LHRH）作用于垂体，促使分泌黄体素（LH）与促卵泡素（FSH）。对LHRH的结构改造获得的LHRHA被称为“超级激动药”，后者对动物及人体的实验表明能使睾酮与精子的产量急速下降，为男性计划生育药的设计开拓了前景。

（二）现有药物改进

许多药物在临床使用过程中，因种种缺陷而受到限制或被淘汰，如半衰期短，导致服用不便等。因此为增加药效，改善吸收，延长作用时间及减少不良反应等，将一些已应用于临床的药物作为先导化合物进行研究已是新药研发的主要来源之一。

1．小范围改变药物取代基 现有药物改进的一种方法是通过小范围改变药物的取代基，这里有两个成功的实例。喹诺酮类是近20年内治疗细菌感染的一大类人工合成的抗菌药并在全球取得了巨大的成功。但这种药物的不良反应较大，如中枢神经系统和光敏等不良反应，使一些患者的耐受性较差。在研究中发现，C8位的H被甲氧基取代可大大降低药物的光敏反应，提高安全性。基于这一发现，格雷沙星（gatifloxacin）和莫西沙星（moxifloxacin）于1999年上市，弥补了三代喹诺酮类药物的不足。用于治疗过敏的抗组胺类药物苯海拉明（diphenhydramine）和氯苯那敏（cholorphenamine）等经典药物因有嗜睡的不良反应从而使其患者人群受到了限制。经改造，一系列非镇静性抗组胺药物相继上市，包括西替利嗪（cetirizine）、氯雷他定（loratadine）、美喹他嗪（mequitazine）等。

2．适当利用药物不良反应 这有可能发现原药的新作用。新型噻嗪类碳酸酐酶抑制药、利尿药是一个成功的实例。传统磺胺在临床大剂量给药时造成患者出现碱性尿和尿量增多等不良反应，是因为磺胺在肾内抑制碳酸酐酶引起Na＋和HCO-3排泄增加所致。对此合成了许多N-1取代的磺胺类衍生物，体外实验结果验证用N1-杂环取代的衍生物可明显地抑制碳酸酐酶，后又将磺酰胺基导入杂环，获得了乙酰唑胺（acetozolamide）成为第一个碳酸酐酶抑制药并开创了噻嗪类利尿药。

药物学家在进行一些药物的药动学研究时发现代谢产物的活性更强，由此以药物活性代谢产物为先导物的开发途径成为了有效途径之一。仍以磺胺为例：起初，人们在发现作为染料的百浪多息可以用于治疗有葡萄球菌引起的败血症，但其在体外无活性，进入生物体内才显示抗菌活性。又发现在服用磺胺的患者尿液内存在对乙酰胺基苯磺酰胺，即磺胺的乙酰化物，研究发现磺胺在体内外均具有抗菌活性，由此将磺胺作为抗菌药物应用于临床，并以此为先导物研发出一系列抗菌药物，从而开创了化学药物治疗细菌感染的新纪元。

（三）合理药物设计

20世纪30-70年代是新药研发的鼎盛期，而进入80年代以后，药物研发的进度有所减缓，这一现象的出现主要是经过近半个世纪的普遍筛选寻求先导物，要想进一步通过各种途径发现全新的先导物已十分困难。于是，随着各种新兴技术的发展，一种全新的寻求先导物的方法诞生了，即通过理论预测与合成检验的不断循环，依据受体或配体的结构来寻求先导物。目前，这种方法已成为最有前景的新药研究方法之一。

1．设计原理 合理药物设计（rational drug design）是依据与药物作用的靶点，即广义上的受体，如酶、受体、离子通道、抗原、病毒、核酸、多糖等，寻找和设计合理的药物分子。主要通过对药物和受体的结构在分子水平甚至电子水平上全面准确地了解，进行基于结构的药物设计和通过对靶点的结构功能与药物作用方式及产生生理活性的机制的认识进行基于机制的药物设计。

2．设计方法 合理药物设计是化学、生物学、数学、物理学以及计算机科学交叉的产物，是在社会对医药需求的强大推动下逐步发展起来的，主要应用各种理论计算方法和分子图形模拟技术来进行合理药物设计。合理药物设计方法包括基于配体的药物设计、基于受体结构的药物设计和基于药物作用机制的药物设计三类。

（1）配体设计：合理药物分子设计必须在已知受体结构模型的条件下才能进行，但到目前为止许多已知药物作用的受体结构是未知的。在未知受体结构时应用合理药物设计的原理和概念开始药物设计也有了不少的尝试，这方面的研究大致可分为两类：探索系列小分子药物三维结构与活性的关系——主要有3D-QSAR；根据已知药物结构反推受体结构模型，再行合理药物设计，如药效基团模型（Pharmacophore Modeling）方法。

①定量构效关系（3D-QSAR）：从对药物与受体相互作用的研究可以知道药物的作用是依赖自身空间形状的，其与受体的作用一般为非共价性质。虽然在未知受体结构时无法进行常规意义上的合理药物设计，但可以在对已知药物研究的基础上进行受体形状推测（receptormapping），将与药物本身形状有关的参数引入到定量构效关系中，称之为3D-QSAR。该方法是基于被研究的分子结合在同一个靶标生物大分子的相同部位的基本假定，将药物的结构信息、理化参数与生物活性进行拟合计算，建立合理的定量关系的数学模型，再以此关系设计新的化合物。不同方法采用不同的结构性质来确定构效关系。

利用小分子三维结构作为参数的三维定量构效关系方法在预测小分子与生物大分子的相互作用时非常有用，各种在化合物三维结构基础上进行三维定量构效关系研究的方法（3DQSAR），在药物研究中已经越来越广泛地应用。主要方法为距离几何（Distance Geometry，DG）、分子形状分析（Molecular Shape Analysis，MSA）、比较分子场分析（Comparative Molecular Field Analysis，CoMFA）以及虚拟受体（Pseudo Receptor）方法。

在3D-QSAR中，CoMFA是目前应用最为广泛的方法，它采用化合物周围的静电场、范德华力场等的空间分布作为化合物结构描述变量，通过最小二乘法建立化合物的生物活性与化合物周围各种力场空间分布之间关系的模型。

CoMFA是在不了解受体结构的情况下，通过将分子势场图示到网格点上来表示分子的周围环境，比较它们与药物分子的生物活性定量关系，用以推测受体的某些性质，并可依次建立起作用模型来设计新的化合物，定量地预测其活性强度。

②药效基团模型：是另一种重要的间接药物合理设计方法。所谓“药效基团”是对一系列活性化合物具有的共同特征（包括特定的化学基团、氢键基团、正负电荷基团和疏水基团等）。药效基团模型方法结合这些药效基团信息，总结出一些对活性至关重要的原子和基团以及空间关系，反推出与之结合的受体的立体形状、结构和性质，推测得到靶点物质信息，即得到虚拟受体模型，来设计新的配基分子。它主要被应用于先导化合物的发现。

（2）受体结构设计：是指一般应用由X线衍射、核磁共振或分子模拟（同源蛋白建模法等）提供的受体三维结构信息，来辅助寻找、设计能够与它发生相互作用并调节其功能的小分子化合物的过程。随着人类基因组计划的完成、蛋白组学迅猛发展，大量的疾病相关基因被发现，使得药物作用的受体生物大分子急剧增加，越来越多的三维结构被测定，有些具有重要药理作用的药物靶点的三维结构虽然目前还没有被测定，但它们的一级结构已被阐明，这时可以采用同源蛋白建模的方法建立其三维结构模型，从而进行直接药物设计。

在药物分子设计中，基于受体的合理药物设计占有极其重要的地位。计算机辅助药物设计成为合理药物设计中的重要工具。一般来说，在通过X-单晶衍射技术或多维NMR获得受体生物大分子结合部位的结构后，就可以采用分子模拟软件分析结合部位的结构性质，特别是静电场、疏水场、氢键作用位点等分布信息，然后再运用数据库搜寻或运用全新药物分子设计技术，识别得到分子形状和理化性质与受体作用位点相匹配的分子结构，合成并测试这些分子的生物活性。经过几轮循环，可发现新的先导化合物。基于受体结构的药物设计包括活性位点分析法（Active Site Analysis）、数据库搜寻法（Database Searching）和全新药物设计（De novo Design）。

①活性位点分析：用来探测与生物大分子的活性具有较好作用的原子或基团。用于分析的探针可以是一些简单的分子或碎片，例如水或苯环，通过分析探针与活性位点的相互作用情况，最终可找到这些分子或碎片在活性部位中的可能结合位置。这也说明活性位点分析法通常不能直接产生完整的配体分子，但它得到的有关受体结合的信息对后面的全新药物设计、分子对接等都有很好的指导意义。

②数据库搜寻：又称计算机虚拟药物筛选（drug screening in silico），是目前发展比较快的计算机辅助药物设计方法之一。它利用计算机人工智能的模式识别技术，把三维结构数据库中的小分子数据逐一与搜寻标准进行匹配，寻找符合特定性质和三维结构形状的小分子，从而发现合适的药物分子。目前数据库搜寻方法分为两类：一类是基于配体的，即根据药效基团模型进行三维结构数据库搜寻。该类方法一般需先建立一系列活性分子的药效构象，提出共有的药效基团，进而在现有的数据库中寻找符合药效基团模型的化合物，主要的软件有Catalyst和Unity。另一类方法是基于受体结构的搜寻，也称为分子对接法，即将小分子配体对接到受体的活性位点，并搜寻其合理的取向和构象，使得配体与受体的几何形状和相互作用的匹配最佳。在药物设计中，分子对接方法主要用来从化合物数据库中搜寻与受体生物大分子有较好亲和力的小分子，从而发现全新的先导化合物。分子对接由于从整体上考虑配体与受体的结合效果，所以能较好地避免方法中容易出现的局部作用较好、整体结合欠佳的情况。数据库搜寻技术发现的化合物大多可以直接购买得到，即使部分化合物不能直接购买得到，其合成路线也较为成熟，可以从专利或文献中查到，可大大加快先导化合物的发现速度。目前，基于超级计算机的计算机虚拟药物筛选方法已成为新药开发的一种重要策略和方法。

③全新药物设计：是指根据受体结合区域的分子表面性质，如空间性、电性、疏水性及氢键等，搜索分子碎片库，让计算机自动构建出与受体结合区域性质互补的虚拟分子片段，然后对产生的系列虚拟分子片段按与受体相互作用能和结构匹配情况来生长虚拟分子，所得到的虚拟分子可以直接当做配体作为数据库搜索的模板或是配合组合化学方法以减少需要合成化合物的数目。

构建药物分子的主要方法有模板定位法、原子生长法、分子碎片法等，其中分子碎片法又包括分子连接法和分子生长法。不管采用何种药物分子构建模式，其方法基本上都要经过3个步骤：分析靶标分子活性部位，确定活性位点各种势场和关键功能残基的分布；采用不同的策略把基本构建单元放置在活性位点中，并生成完整的分子；计算生成的新分子与受体分子的结合能，预测分子的生物活性。

基于受体结构的药物设计方法的最大优势在于它是基于靶点的“有的放矢”型，能够很快设计和优化出高效配体。但它仍然属于定向合成和筛选，即使目标化合物有很强的受体亲和活性，一旦在生物利用度、体内代谢感毒性测试中落选，基本上将意味着药物开发的失败。而且近年来的研究发现，ADME／TOX分析在开发新药的早期阶段是一个关键的因素。所以，在基于受体结构进行先导物分子设计的过程中，必须要把设计的化合物在体内的吸收、分布、代谢、排泄和毒理方面的性质同时考虑进去。将基于结构和基于药物作用机制的计算机辅助药物设计方法相结合，将会在新药的发现中发挥更大的作用。

这种方法的优势在于有可能构造出全新结构的先导化合物，局限性在于设计的化合物在化学合成上可能存在困难，分子设计的成功率较低。

（3）药物作用机制：此设计方法是在基于结构的药物设计基础上，进一步考虑了药物与受体的动态结合过程，药物对受体构象的调节以及药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄。基于机制的药物设计兼顾了药物在体内作用的各个方面，可以选择性地阻止疾病发生和发展过程中最关键的病理环节，设计出高效、低毒副反应的特异性药物。

在过去，对药物作用机制的认识往往滞后于药物的发现，而现在药物研发的重心已经转到了探寻分子机制并据此设计药物上。而药物设计技术是基于对介导疾病病理生理过程的蛋白质分子结构和功能认识基础之上的。目前投入临床使用的某些药物，不少是基于对治疗该种特定病理条件的靶向代谢过程的认识开发而成的，其中较为成功例子就是抗抑郁药氟西汀。此药被开发用于替代单胺氧化酶抑制药（MAOI）和19世纪50年代出现的三环类抗抑郁药，因为这两类药物相对来说作用不特异，临床应用会导致明显的不良反应。当时研究人员普遍认为，只要增加5-羟色胺的神经释放、研制某些可以抑制神经突触处5-羟色胺摄入的抗组胺药物或提高5-羟色胺的有效浓度，即可起到有效抗抑郁作用。基于这一理论，由抗组胺药物盐酸苯海拉明衍生而来的候选化合物被先后合成，并发现了选择性5-羟色胺再摄取抑制药（SSRI）氟西汀，现在氟西汀正被礼来公司以商品名Proxac上市。氟西汀的发现和成功说明了当前以理论为基础的药物研发工作的重要性。

合理药物设计不仅用于先导化合物的优化，更重要的是能进行先导化合物的人工设计，这为突破现有先导化合物框架，发现新的、更高效的药物提供了工具。

合理药物设计是药物研究领域的一个重要的里程碑，这一方法的确立标志着人类对于生命过程的认识达到了一个新的水平，对生命体的一些过程的认识不再简单地依靠于实验的拟合结果，可以在一定的理论基础上进行人为的预测和设计了。可以说，在药理方面，人类已经开始进行第一轮的演绎而不仅仅是归纳了。但是，并不能因此片面夸大合理药物设计的作用，在药物设计的道路上仍然存在一系列问题需要解决，如蛋白质受体三维结构的真实性问题；受体-配体相互作用的方式问题；设计出来的配体的化学合成问题；药物的体内转运及代谢问题；药物的体内毒副反应问题等。相信经过不懈努力，这些问题一定会逐步解决，合理药物设计也会充分显示其优越性，并达到一个新的水平。

总之，合理药物设计只是开发新药的一个重要环节，它还需要化学合成和药理、毒理测试等的密切配合。理想的开发新药之路应是“理论计算-药物设计-化学合成-药理测试”，四个环节缺一不可，一般还要经过多次循环过程，才能达到开发新药的目的。

（四）组合化学和化合物组合化学库

1．组合化学（combinatorial chemistry） 是一种合成策略，是将一些基本的小分子（称为构造砖块，如氨基酸、核苷酸、单糖以及各种各样的化学小分子）通过化学或生物合成的程序将这些构造砖块系统地装配成不同的组合，目的是得到大量的、具有多样性特征的化合物，建立大容量的化合物库：再结合群集筛选方法，用于新药研究和开发中的先导化合物的发现。基本原理是在芯片或合成珠等固体相载体材料表面，通过连接功能进行原位合成、原位筛选。

组合化学是药物化学研究领域中的一大成就，它融合了新型合成技术和高通量群集筛选技术的优点，突破了逐一合成和评价的传统研究模式，使一次合成数百个化合物甚至数万个化合物成为可能，研究工作效率得到极大提高。近二十年来，组合化学已经显示了它的旺盛生命力，成为化学、药学等科学研究中的热点。

2．化合物组合化学库 是指巨大数量的不同结构的化合物的储藏和检索。它源自巨大数量、不同构件进行不同形式的键合反应。所有化合物或以自由分子的形式存在于液相（多为二甲亚砜）中，或以连接于固相载体的形式储藏备用。利用组合化学方法建立起大容量的化合物组合化学库后，开始对化合物库进行有针对性的高通量筛选。例如Smith Kline Beecham公司针对克隆表达的人类5-HT6受体对化合物库进行了高通量筛选，确定了二芳基磺酰胺，经过结构修饰，又获得了选择性更高（对5-HT6受体的亲和力比其他50余种受体、酶和离子通道高200倍以上）、口服生物利用度更好（＞80%）的强效5-HT6受体拮抗药SB271046，目前已进入Ⅰ期临床试验阶段。又如Glaxo Smith Kline公司通过对10 000个羧酸化合物组成的化合物库的筛选，发现了对PPARδ受体有活性的化合物GW8547，结构修饰后，得到了强效、高选择性的PPARδ激动药GW501516，目前在临床上作为治疗与心血管有关的某一代谢综合征的候选药物。

近年来，在组合化学和化合物组合化学库的基础上又发展了动态组合化学和动态组合化学库，并应用于药物开发当中。动态组合化学最引人之处在于模板指导库中某化合物的放大。当以酶、受体型蛋白等作为模板加入到动态组合化学库中，库中与之最有亲和力的成分就被放大，而与之无作用的成分将减少，这些放大的成分是该库中最有可能成为先导化合物的成分。

（五）基因重组技术

利用基因重组技术合成结构复杂的天然化合物及利用微生物产生新结构类型活性物组成基因重组库。如微生物次级代谢产物合成途径中的有些酶的底物特异性不强，因此将两种合成途径相似的抗生素生物合成基因进行重组，使之合成与两亲株的产物不同的“杂交”抗生素，已有一些成功的报道。Tanaka等利用基因重组技术研究脑血管痉挛动物模型基因表达变化，发现了脑血管痉挛治疗靶血红素氧化酶-1。最近又通过靶基因定位断裂作用改变Sacchrroplyspora Erythreus的红霉素生物合成结构基因，使之产生一新的衍生物6-去氧红霉素。

利用基因重组技术可以将一些靶酶的活性中心、受体或受体的亚基等在微生物中大量表达，满足了大规模筛选样品的需要，并且可以用来确定一些不甚清楚的药物作用靶位。