生化药理学方法

生化药理学是药理学的一个重要分支，它主要研究受体、离子通道、酶和自由基等在生理和病理过程中的作用，以及药物对它们的影响。近年来，随着其他学科的技术的迅猛发展及在药理学方面的应用，生化药理学得到了很快的发展。目前，生化药理学的技术主要包括：酶联免疫吸附技术、放射性活性检测技术、DNA微阵列技术等。

（一）酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是1971年由瑞典的Engvall等建立的一种生物活性物质微量测定新技术，以其灵敏度高、特异性好等优点，在生命科学各领域得到广泛应用。近年来，该技术不断改进，形成了多种分析方法，并且在检测的灵敏度、特异性、操作简单化、高效性等方面都有很大提高。ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用。正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。目前，ELISA的新技术包括如下几种。

1．斑点ELISA法 又称斑点ELISA试验（Dot-ELISA），或点免疫结合法或抗原斑点试验，是Hawkes等参照核酶的斑点杂交法改良而成的，是以纤维素膜为载体的一种新型免疫检测技术。已被广泛应用于免疫印记单克隆抗体鉴定及各种抗原-抗体体系的检测。其实验效果不仅与NC膜做载体的常规ELISA无异，而且有许多优点，载体和容器合一，操作方便；孔底薄吸热性好，有利于各试剂快速结合；点抗原不扩散，斑点色度增加等。

2．聚合酶链式反应-ELISA法 聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学技术检测DNA最灵敏的方法之一。而酶联免疫吸附测定法（ELISA）是免疫学中最敏感和特异的检测方法的代表。聚合酶链式反应-ELISA法（PCR-ELISA）集合了上述两种方法的精髓，成为继PCR之后的又一个灵敏性更高、特异性更强、省时易行的新方法。这类方法首先是利用生物素（Bio）、地高辛（Dig）对PCR产物进行双重标记，具体标记方法有三种。

（1）在PCR扩增体系中同时加入Bio和Dig标记的脱氧核苷酸类似物（Bio／Dig-dUTP）。

（2）在扩增体系中使用Dig标记的引物和Dig-dUTP。

（3）分别利用Bio和Dig标记两条引物。

采用上述方法后，扩增出的PCR产物就被同时标记上了Bio和Dig。然后，将双重标记的PCR产物固定在包被有链霉亲和素的固相载体上，再加入碱性磷酸酶（AP）标记的抗Dig抗体与PCR产物中的Dig特异结合，根据AP底物不同，通过显色或化学发光进行定量检测。这类方法里也有只给PCR产物标记Bio的，然后利用Bio将PCR产物吸附在包被有链霉亲和素的固相载体上，接下来变性解链，用荧光素标记的探针杂交，最后加入辣根过氧化物酶标记的荧光素抗体，显色定量。

（二）放射性活性检测技术

目前，放射性活性检测技术很多，现主要介绍亲和闪烁技术。

亲和闪烁分析在细胞表面受体药物筛选中应用较广泛。该检测方法的原理是通过亲和结合将放射配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少放射配基标记分析中游离配基与结合配基的结合过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行，在更大程度上适应基于细胞膜型的高通量药物筛选。亲和闪烁分析技术无需烦琐的分离步骤，它不仅是配体-受体相互作用的理想检测技术，也适应于免疫测定。另外，此技术也曾被用来研究过氧化物酶体增殖激活受体的配体筛选。荧光成像读板仪在短时间内可以同时检测荧光的强度和变化、测定细胞内钙离子浓度、检测离子通道以及G蛋白偶联受体。此项技术已用于确定孤儿G蛋白偶联受体的同源配体，具有极强实时性，易于实施的优点，但是这种筛选方法需要耗费大量人力，而且只局限于96／384孔板。

（三）DNA微阵列技术

DNA微阵列技术（DNA microarray），又称DNA芯片（DNA chip），是指在固体表面（玻璃片或尼龙膜）上固定成千上万DNA克隆片段，人工合成的寡核苷酸片段，用荧光或其他标记的mRNA、cDNA或基因组DNA探针进行杂交，从而同时快速检测多个基因表达状况或发现新基因，快速检测DNA序列突变，绘制SNP遗传连锁图，进行DNA序列分析等的一种新技术，其基本原理是基于Southern杂交或斑点杂交技术。微阵列实验包括从2种不同条件下得到的mRNA通过反转录生成带有荧光标记的cDNA，其中常用的荧光标记是Cy3（绿光）和Cy5（红光）。随后，将标记好的cDNA混合物与事先点在微阵列玻片上的大量靶标进行杂交，通过激光扫描仪对每个基因上的杂交信号进行定量。一个靶标位置上的荧光值很高则说明这个基因是表达上调的，反之就是表达下调的。

典型的微阵列实验包括3个主要步骤，即微阵列的制备、制备荧光标记的cDNA探针和随后的杂交实验、最后通过激光扫描仪扫描形成TIFF格式的图片并通过生物信息学的方法对其产生的数据进行分析。

1．cDNA微阵列的制备 通过点样机械手，把事先变性的双链cDNA点到玻璃或尼龙膜等固体支持物上。制备cDNA微阵列主要包括2个步骤，首先通过PCR方法扩增cDNA片段，然后再将扩增出来的片段高密度地点到微小的载玻片上。一般cDNA微阵列是以玻片为载体的，但也可以点在硝酸纤维素膜或是带电尼龙膜上，后者一般称为纸阵列或宏阵列。玻片材料的微阵列可以同时在一张微阵列上进行实验组和对照组基因差异表达的比较，而纸阵列则需要分别在2张微阵列上对实验组和对照组的基因表达进行分析。纸阵列的优势在于它是同位素标记的，可以通过洗膜多次使用；而玻片微阵列只能使用一次，并且还需要高成本的标记试剂盒以及激光扫描仪。

2．荧光标记cDNA的制备及杂交 标记过程主要是RNA在反转录过程中不断把荧光材料掺入到cDNA中，从而对反转录出来的cDNA进行标记。最常用的是用Cy3（绿色）染料标记对照组的cDNA，用Cy5（红色）标记实验组的cDNA。反转录反应中可以使用总RNA或以mRNA做模板进行反转录。现在使用的标记方法主要有直接和间接法两种。直接标记是采用酶学或化学手段，将荧光素通过共价的方式直接连接到探针分子上；间接标记是通过利用树状聚合物分子、抗体或其他试剂，把荧光素分子以非共价和间接的方式连接到探针分子上。直接标记法简单，可以省略杂交后的烦琐和费时的操作；反转录直接标记法和其他能够进行信号放大的非直接标记法相比，其探测灵敏度较低。与其他杂交过程一样，微阵列实验也要求杂交信号特异性强并且背景低，如果实验过程中有气泡产生而带来高背景，将会影响实验结果的分析。

3．扫描图片分析和数据分析 杂交实验完成后，把共聚焦激光扫描仪光源调整到合适的波长去激发Cy3和Cy5标记的探针，从而形成2张独立的16位TIFF格式的图片，这些图片随后被用来分析每个基因的相对表达水平。从图片中获得的原始数据还需要进一步的分析，从而形成具有列表形式的基因表达差异数据。

（1）图片分析：包括信号点的识别、背景测定及背景削减后各探针的荧光信号。探针的沉淀、杂交时的假象，以及灰尘的污染都可能成为假信号点。但由于每个信号点是在制备微阵列时已经确定好了的，因此可以很容易地把信号点从假信号点中区分开来。有很多商业化的扫描仪都提供了相配套的信号点识别软件。此外，很多网络站点也提供免费软件供研究者使用。接下来就是对杂交背景的评估。杂交背景通常是指每个信号点附近的荧光值，通过背景削减后的荧光强度值就可以表示成每个信号点的信号强度。Cy3和Cy5的信号强度的比值被用来表示基因表达的差异情况。

（2）数据分析：首先要通过数据归一化处理，目的是对探针标记中的差异、扫描仪对每个荧光探针识别能力的不同以及RNA质量的差异进行调整。常用的方法是全局信号强度归一化。因为每个样品中用于标记的总RNA是相同的，所以全局信号强度的总和也是一样的。全局信号强度归一化的方法不适合不同生物学组织来源或是不同批次的微阵列实验数据，主要是因为每个微阵列中各数据点的全局强度和信号中位值可能有很大的差别。解决方法之一是利用持家基因（housekeeping gene）；第二种方法是在每一次标记反应中添加少量的外源性对照样品（如mRNA），并根据相应对照点的信号强度对每一图像进行归一化；第三种方法是每次实验的同一检测通道加入通用对照样品，根据其信号强度对每一测试样品进行归一化。归一化后，基因差异表达量就被确定。样品与对照组的荧光强度比值表示基因的表达差异，当两者的比值为1时表示基因表达没有改变；比值＜1时，表示样品组的基因表达下调；比值＞1时，表示样品组的基因表达上调。一般当基因表达量的改变在2倍以上时认为基因表达有差异。

4．DNA微阵列技术 有助于识别药物相应的靶序列，分析整个基因组药物作用，并监视药物治疗反应中的基因表达改变，检查药效是研究药物作用机制的新方法。DNA微阵列不仅可提供不同个体药物代谢的多态性信息，还可用于鉴别药物反应中差异性表达的基因。DNA微阵列可以分析动物模型系统中的基因表达，这对新药设计是至关重要的。DNA微阵列还可用于分析代谢旁路，研究细胞对药物反应，监视具有生物毒性潜能的基因表达；观察不同药物对疾病治疗的代谢调控作用，选择合适的治疗方案；预测药物功效和不良反应。例如，DNA微阵列技术可用于药物敏感和耐受的有关基因的发现。肿瘤细胞产生耐药性的机制有多种，肿瘤抑制基因、生长因子受体、DNA修复因子和细胞死亡调控因子等各种基因群都被认为与肿瘤细胞耐药性的发生有关。因此，细胞耐药性的产生很可能是不同基因表达变化影响了细胞生化过程的结果。有研究通过cDNA微阵列，比较了用阿霉素处理的肿瘤细胞和未用阿霉素处理的细胞之间的基因表达差异，发现阿霉素处理的细胞中有一组基因是组成型表达，它们很可能是肿瘤细胞具有阿霉素耐受性表型的一个重要的标志物。这一研究表明，使用cDNA微阵列对潜在的分子图谱的研究及抗肿瘤药物的筛选是可行的。