细胞药理学方法

细胞药理学是采用细胞生物学技术，研究药物在细胞水平的药效学、药动学及作用机制的学科。近年来发展很迅速，而且将来发展的空间很广阔。常用的细胞药理学技术主要包括：细胞培养技术、Caco-2细胞模型、MTT法、膜片钳技术等，现概述如下。

（一）细胞培养技术

细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。培养细胞的形态分类：贴附型和悬浮型。细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。

1．无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比，细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

2．恒定的温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为（36．5±0．5）℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39～40℃1h，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40～41℃1h，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41～42℃1h，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃持续1h以上，细胞全部死亡。

3．气体环境 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH。大多数细胞的适宜pH为7．2～7．4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。细胞培养液pH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但CO2易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫黄酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止pH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH。

4．细胞培养基 培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好地生长增殖。使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质，能使细胞顺利增殖生长。

（二）Caco-2细胞模型

现代药物研发成功与否与药物的吸收、分布、代谢、排泄等药物代谢特性密切相关。无论是开发新药还是开发新的给药途径，化合物在体内的吸收特性都非常重要。

1．药物吸收筛选模型

（1）以往传统的体内药代吸收筛选模型，由于所需药物量大、难以批量化、耗时长以及费用高等弊端，已经无法满足现代新药的研发要求，因而开发新的快速、准确，以及需药量少的药物吸收筛选模型已成为新药研发的必然趋势。

（2）目前，被广泛采用的三种筛选方法是：大鼠原位单次灌注法、大鼠外翻肠囊法及体外人结肠腺癌（Caco-2）细胞系法。其中，Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。从20世纪80年代起，国外药物研究实验室和制药公司开始应用一种人结肠癌细胞Caco-2（the human colon carcinoma cell lines）体外培养模型进行药物吸收动力学的研究。Caco-2细胞模型在筛选口服候选药的小肠渗透性、大分子和小分子的药物吸收和转运机制，辅助成分对药物通透性的影响和研究药物代谢方面都有应用，获得的信息对合理确定临床给药方案及指导制剂的处方设计都有重要意义。

2．培养成熟的Caco-2细胞的特点 Caco-2细胞系来自人体结肠癌细胞，培养成熟的Caco-2细胞可形成致密的单细胞层组织，其形态和功能上与人体的小肠上皮细胞相似。在肠腔侧分化出绒毛面侧和基底面侧。绒毛面含有典型的小肠微绒毛水解酶和各种营养物质转运载体，可发挥主动转运物质的作用。研究表明具有氨肽酶、碱性磷酸酯酶、蔗糖酶和寡肽转运载体PepT-1，Ⅰ相代谢酶CYP1A1和Ⅱ相代谢酶硫黄基转移酶、葡萄苷酸酶和谷胱甘肽S-转移酶在Caco-2细胞中也存在，并保持了P-糖蛋白高表达的特征。以上特点决定了Caco-2细胞模型可用于药物吸收动力学的研究。但是Caco-2细胞也有不足，如缺乏黏蛋白产生细胞，因此缺少肠壁的黏液层；细胞结构单一致密；缺少部分代谢酶；常规Caco-2细胞培养周期长。但随着新一代细胞模型的建立，可使原有的Caco-2细胞模型中的一些缺点得到克服，Caco-2细胞模型在研究药物的转运机制、预测药物的小肠吸收情况以及药物在肠道的代谢中的应用范围将不断拓宽。

（三）MTT法

MTT法是20世纪80年代发展起来的一种快速、简便的以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础的一种检测细胞数量的方法，由Mosmann等在1983年首先在鼠淋巴细胞系的研究中应用于检测IL-2等细胞因子对细胞存活和增殖的影响。

1．基本原理与特点 四甲基偶氮唑盐［3-（4，5-dimethylthiazol-2yl）-2，5-diphenylterazolium bromide，MTT］为黄色化合物，是一种接受氧离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下在细胞内生成蓝紫色的甲瓒（formazan）结晶，甲瓒的生成量仅与活细胞数目成正比，死细胞及红细胞均无生成甲瓒的能力。甲瓒可溶解于二甲亚砜（DMSO）中，通过分光光度仪测出吸光度值即可定量分析，以反映出活细胞数目。虽然MTT法受到很多因素的影响，如结果与操作方法规范与否，对标本的纯化处理程度，细胞接种量，药物与细胞作用的时间，以及药物的体内外代谢差异及药物相互作用，DMSO溶液的稳定性等，对这些因素进行深入的研究，以及确立指南性的操作流程规范仍需要作出大量的工作，但总的来说，MTT法具有实验方法简便、实验所需时间短以及可以大规模用于临床检测等优点，自发明以来，不断得到改进并得到广泛应用，尤其在恶性肿瘤的药敏试验中方法日臻完善。

2．肿瘤细胞耐药性检测 肿瘤细胞耐药性按来源可分为内在耐药性和获得性耐药性，按耐药表型可分为原药耐药（primary drug resistance，PDR）和多药耐药（multi drug resistance，MDR）。肿瘤MDR是导致肿瘤化疗失败的最主要原因，其耐药机制已成为国内外学者研究的热点之一，有学者指出细胞膜或核膜蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白和乳腺癌耐药蛋白等，能使细胞内药物外排增加或囊泡隔离，导致细胞内药物浓度降低或药物分布改变。肿瘤患者体内MDR1／P-gp的阳性表达与化疗耐药有关，且化疗可诱导MDR1／P-gp表达，其表达水平与化疗敏感性相关。自20世纪90年代以来有许多研究报道，利用MTT法检测原代肿瘤细胞对临床常用化疗药物的敏感性，并指导临床用药，在MTT指导下的个体化辅助化疗患者的5年生存率比经验化疗和不化疗的患者都有明显的提高。

（四）膜片钳技术

1．基本原理 膜片钳技术是用微玻管电极（尖端直径1～5μm）接触细胞膜而不刺入，然后在微电极另一端开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口。这样在这小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，在理想的情况下其电阻可达数个或数十个千兆欧姆以上的阻抗封接，使与电极尖开口处相连的细胞膜的小区域（膜片）与其周围的细胞膜在电学上完全分隔。如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白质分子，那么通过此微电极就可测出单一通道开放时的离子电流和电导，并能对单通道的其他功能特性进行分析。

2．离子通道的作用 离子通道在许多细胞活动中都起关键作用，它是生物电活动的基础，在细胞内和细胞间信号传递中起着重要作用。随着基因组测序工作的完成，更多的离子通道基因被鉴定出来，离子通道基因约占1．5%，至少有400个基因编码离子通道。相应的由于离子通道功能改变所引起的中枢及外周疾病也越来越受到重视。以离子通道作为靶标的药物现占总靶标的5%，而潜在的离子通道靶标药物将占总靶标的25%，因此开发离子通道为靶标的药物将具有广阔的市场前景。已知与离子通道有关的疾病主要有癫、心律失常、糖尿病、高血压、舞蹈症、帕金森症等。

3．主要优、缺点

（1）优点：对细胞膜通道电流的记录具有很高的分辨率；信息含量大；能够改变细胞膜电位，进行单细胞记录，同时可以控制改变细胞的内外溶液成分，灵活性好；应用范围广；可以分析检测所有的离子通道类型；能记录到pA级电流变化和单通道开关状态，因此具有很高的高灵敏性；相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权威性和精确性。

（2）缺点或不足：要求配备精细的微操作设备、高倍的光学放大器、震动控制，以及操作经验丰富的熟练的实验员，且通量较低。而全自动膜片钳技术是离子通道检测技术的最新进展，它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。

近年来，在多个方面作出新的突破，如高的实验通量表现，较高的自动化程度、良好的封接质量、微量加样等。目前，该技术在以离子通道为靶标的药物研发，药物毒理测试，以及虚拟药筛等方面有广阔的应用前景。

4．可与其他技术结合 1991年，Eber Wine和Yeh等首先将膜片钳技术与PCR技术结合起来运用，其具体方法是：用全细胞膜片钳记录培养细胞或制备脑片的生物物理学和药理学特征，然后将细胞胞质内容物收集入膜片微吸管尖内，再把胞质RNA反转录成cDNA，然后用PCR直接扩增，PCR的产物通过凝胶电泳和DNA序列进行分析。这两项技术的结合可对形态相似，而电活动不同的细胞做出分子水平的解释。这样在观察电生理功能的同时，分析有关基因表达改变的情况，成功地实现了在单个细胞内同时研究功能与分子的变化。

总之，在过去的几十年间，膜片钳技术的研究主要以离体标本为主。但是，如想研究一些外界刺激对神经系统的影响，在离体标本上是无法实现的，而且离体的细胞和分子水平研究和整体的真实情况可能存在较大的差异。因此，在活体动物上对微小生命活动进行直接观察一直是追求的目标。早期对神经系统的整体电生理学研究，以胞外记录为主，由于技术方法的局限性，忽略了大量有价值的生物信号。最近出现的在体膜片钳技术可以较好地解决这一问题，可在动物整体无损的前提下，深入研究大脑和脊髓神经元离子通道和突触活动的特点，以及病理变化和药理作用。在体膜片钳是指在麻醉动物上直接对其脊髓或大脑神经元进行膜片钳记录的技术，与分散神经元或组织片膜片钳技术比，最突出的优点是能够在施加外界刺激的同时，在整体条件下研究中枢神经元离子通道和突触活动的特点，为从宏观角度研究和探讨中枢神经系统的生物物理现象提供了更精确的手段。整体动物实验反映的生理活动是体内各种生命过程的综合表现，不仅视觉、听觉、触觉等必须应用整体动物模型，其他基本的神经生理活动的本质也将随着高新技术的出现，以无损伤非侵入式的方式，在整体动物模型上得到证明。因此，应用在体膜片钳技术将会成为必然的选择。虽然在体膜片钳技术的研究应用还处于起步阶段，但最终是为了实现对神经元显微结构和功能的实时定量研究。相信随着科学技术的全面发展，在体膜片钳技术所面临的困难将一一解决。

（宋光明 孙 静）

参考文献

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［3］蒋学华．药物现代评价方法．北京：人民卫生出版社，2008．

［4］刘昌孝．药物评价学．北京：化学工业出版社，2006．

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