分析方法学确证

生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药动学研究的基础。所有药动学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。

1．特异性 是指在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得对样品测定造成干扰。对于色谱法至少要考察6个不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于以软电离质谱为基础的检测法（LC-MS、LCMS-MS）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。

2．标准曲线与定量范围 用至少5个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物介质，定量范围要能覆盖全部待测浓度，不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。微生物学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的，所以尽可能采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线。根据所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法获得标准曲线。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。

3．精密度与准确度 质控样品指在空白生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。一般选择3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在定量下限附近，其浓度在定量下限的3倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品，为获得批间精密度，应至少连续3个分析批合格。精密度相对标准差一般应＜15%，在定量下限附近相对标准差应＜20%。准确度一般应在85%～115%范围内，在定量下限附近应在80%～120%范围内。

4．定量下限 是标准曲线上的最低浓度点，要求至少能满足测定3～5个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1／10～1／20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，相对偏差应＜20%。应由至少5个标准样品测试结果证明。

5．提取回收率 从生物样本中回收得到分析物质的响应值除以相同浓度标准品产生的响应值即为提取回收率。考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应精密且重现。

6．样品稳定性 根据具体情况，对含药生物样品在室温、冻存和冻融循环等影响因素下样品稳定性进行考察，以确定生物样品稳定的存放条件和时间，应在确保样品稳定的条件下进行保存和测定。