其他病原体的微生物学检测

引起肺炎的病原体包括肺炎支原体（Mycoplasma Pneumoniae）、肺炎衣原体（Chlamydia Pneumoniae）、鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）和贝纳立克次体（Coxiella burnetii，常称Q热立克次体）。本节简要介绍这几种病原体的微生物检测方法。这些病原体的实验室分离应注意安全防护，要严格遵守实验室生物安全规则，以防环境污染和实验室感染。

一、肺炎支原体的微生物学检测

1．标本的采集（基本方法参照第3章第三节相关内容）

（1）拭子要求：为藻酸钙、涤纶、聚酯纤维等材料制作，柄为塑料或铝质。

（2）采集：一般取患者的痰、咽拭子、鼻咽洗液、支气管分泌物等，以拭子标本最好，持拭子用力擦下尽可能多的细胞，因为支原体与细胞相伴随。取材后立即接种，或置于转运培养液中，4℃保存72h。

2．分离培养　分离培养阳性率不高对临床快速诊断意义不大，但对流行病学调查有重要意义。

（1）培养基：常用培养液以牛心消化液为基础，另加20%小牛血清及新鲜酵母浸液制成液体或固体培养基。在培养基中适当加入亚甲蓝、青霉素、醋酸铊以抑制杂菌污染。已经有成品培养基销售，无论是自制培养基或使用商业成品培养基，均应进行质量控制（如阳性对照菌株的生长）以保证培养基的质量。肺炎支原体的培养使用双相培养基（肉汤－琼脂培养技术）则更好。

（2）标本接种前的准备：标本在接种前应当混匀，液体标本离心沉淀，取沉淀物用于接种。组织标本在肉汤内剪碎后接种。无论液体标本还是剪碎的组织标本，在接种前需用相应的专用肉汤作10倍连续稀释，至少三个稀释度（如1∶10，1∶100和1∶1000），每一稀释度均做接种。稀释目的是减少标本中可能的抗生素、抗体和细菌的干扰。

（3）操作步骤：将系列稀释的标本在肉汤和琼脂平板培养，肉汤置有氧环境，琼脂平板置5%CO2，37℃培养。初次分离生长缓慢，一般10d左右长出菌落。如果接种的肉汤在4d以后发生由红变黄的产酸反应时，检查原种的琼脂平板是否有菌落生长，若无生长，则将阳性肉汤转种琼脂平板，转种4d后每2～3d检查原种和转种的琼脂平板，通常在接种后4～20d产生直径为10～100μm的菌落，然后进行肺炎支原体鉴定。如果原种的肉汤在10～21d内没有颜色改变，将该肉汤转种琼脂平板，4周后仍然没有菌落产生，则培养阴性。

3．结果的解释　呼吸道标本接种肉汤分解葡萄糖产酸，接种或转种琼脂平板后4～20d产生圆形菌落，使用PCR或双单抗体夹心ELISA检测分离物的肺炎支原体DNA或抗原确诊。

二、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体的微生物学检测

1．标本的采集

（1）肺炎衣原体采集后鼻咽、喉拭子、痰或胸腔积液标本，其中鼻咽拭子分离率最高，拭子既应注意防污染，亦要防止细胞和肺炎衣原体受抑制。标本通常置于加抗生素和小牛血清的蔗糖磷酸缓冲液，4℃保存不超过24h。

（2）鹦鹉热衣原体：采集患者血、痰或者咽喉含漱液。

2．直接检出　衣原体在宿主细胞质内出现包涵体，用光学显微镜可以观察，阳性率低，对经验要求较高。

3．细胞培养

（1）衣原体不能在无生命的培养基上生长，只能进行细胞培养，三种实验系统可用于衣原体的分离：接种鸡胚卵黄囊、离心接种细胞和鹦鹉热衣原体不离心直接种细胞。

（2）细胞培养：分离细胞系有猴肾、McCoy、HEP－2和HL等。肺炎衣原体在HEP－2和HL细胞系培养敏感。衣原体分离培养液：含10%胎牛血清Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM），万古霉素50μg／ml，庆大霉素50μg／ml，两性霉素B 2．5μg／ml，放线菌酮1～2μg／ml。

（3）培养方法有盖片小瓶和微量滴定板两种：前者为细胞长在玻璃小瓶内的盖片上，后者用96孔（或24、48孔内置盖片）的平底塑料板培养，常在大量标本分离时使用。每份标本接种2瓶（孔），应有阳性和阴性对照。塑料板法不如小瓶培养敏感，而且需置5%CO2培养。将已经长成单层细胞的瓶（孔）内培养液吸去，加0．1～1ml标本，1 500g离心45～60min，35℃孵育1～2h，换加1～2μg／ml放线菌酮的生长培养液1ml，35℃培养48～72h。鹦鹉热衣原体分离常需要延长孵育时间5～10d才能检查。

（4）衣原体分离物的鉴定：塑料板培养可用倒置显微镜直接检查。碘和Giemsa染色法显示典型的细胞内包涵体，荧光抗体染色技术则从形态学和免疫学两方面对分离物进行鉴定，故具有更高的敏感性和特异性，阳性标本可见荧光染色（苹果绿色）的包涵体和原体。抗肺炎衣原体种特异性MAbs可确定衣原体分离物的种。

4．结果的解释　肺炎衣原体培养的技术要求更高，且阳性率很低，即使在国外也不是一般实验室所能开展的，因此，血清学是实验室诊断的主要选择。鹦鹉热发病罕见，培养检测的实验室生物安全要求很高，因此实验室诊断也基本依靠血清学。

三、Q热立克次体的微生物学检测

Q热立克次体对人感染力强，经空气传播，因而必须注意防止实验室感染，特别是在进行实验室病原学诊断操作时，应切实遵守国家生物安全操作规范和各项工作制度。

1．标本采集

（1）血液为最常用的分离标本，病程第1周内，尽量争取在使用抗生素前采血5～10mL，立即在患者床侧接种动物，也可将血液置于容器内脱纤维，或加入肝素抗凝。若在发病1周后采血，最好使血液凝固，留血清供血清学诊断，再将血块制成20%～50%悬液接种动物，以避免血清中可能存在的抗体或抗生素（如已开始治疗）对病原体分离的影响。

（2）活检或尸检标本：肺、肝、脾、淋巴结、心瓣膜赘生物等标本，除用于制作印片供直接检查及一部分固定作病理检验外，可分别研磨并稀释制成10%～20%悬液，低速离心后取上清接种。

2．直接检出　常规染色镜检：对于制作的血印片、脏器印片或细胞培养涂片，经丙酮或乙醚固定后行Giemsa 或Gimenez染色，镜检。

3．病原体分离

（1）组织培养法与鸡胚卵黄囊法：取发病早期血清接种到p388DI和L929细胞内或鸡胚卵黄囊上。Q热立克次体生长缓慢，培养10～12d。

（2）动物接种：初代分离多用豚鼠。每日观察动物，注意其活动及饮食等有无异常状况。接种前测体温数日，并采血备用作血清学试验，以确定是否有隐性感染，亦作为接种感染材料后的血清学对照。接种时，将患者血液或其他标本悬液注入2～4只豚鼠腹腔，每只1～3ml。每日于同一时间测温，体温上升至40℃为发热。发热潜伏期随标本中病原体数量和毒力不同而有差异，一般在初代分离时往往较长，而传代以后则逐渐缩短。一般试验豚鼠在发热高峰时采血或解剖取脏器制成悬液传代、接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以繁殖立克次体；另一半留至恢复期（一般在接种后28d）采血，测特异性抗体。初代分离时也可有些豚鼠并不发病或只是顿挫型感染（发热不典型）。对没有发热反应的试验豚鼠应盲传3代，如仍不发热及无抗体出现者即可停止传代试验。感染豚鼠除发热外，有些立克次体可引起阴囊反应，一般很少死亡。在睾丸鞘膜的涂片中可查到立克次体，而脾印片的常规染色常难发现病原体，用免疫荧光法检查可提高立克次体的检出率，也可达到快速鉴定的目的。

（朱　静　于　勇　陈建魁　尹秀云　李伯安　郭桐生）

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