呼吸道感染菌的耐药基因检测

一、mecA基因的检测

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA）是一种对所有β－内酞胺类抗生素具有多药耐药性的重要病原体。有证据表明，耐甲氧基乙酰苯胺的菌株是在应用氟氯西林等进行治疗的情况下诱导产生的mecA编码的甲氧基乙酰苯胺抗性，可被传递给本来敏感的细菌。快速分离和鉴定MRSA则是控制MRSA传播的关键。PCR技术满足了这一临床要求，成为检测MRSA的可靠手段。

femB基因可作为检测MRSA和甲氧基乙酰苯胺酶敏感的金黄色葡萄球菌的特异性标志。mecA则是编码甲氧基乙酰苯胺抗性的基因，运用多重PCR，同时扩增femB和mecA的特异性DNA，即可检出金黄色葡萄球菌并确定其是否是MRSA。在不具备PCR的条件下，探针技术则是检测mec基因的良好手段。循环探针技术（cycling probe technology，CPT）是又一种基于DNA杂交的检测方法。该方法利用段特异的5′端和3′端分别标记荧光素和生物素的DNA－RNA－DNA探针，与待检测DNA退火，在RNase H作用下切除RNA部分，使被切片段从靶位上分离，使其能用于进一步循环。通过抗生物素抗体包被的酶联板捕捉未被切开的探针，再加以辣根过氧化物酶标记抗荧光素抗体，从而确定mecA基因的有无。该方法可在2h内完成。

二、vanA、vanB、vanC基因的检测

vanA、vanB是编码万古霉素抗性的主要基因。vanC－1、VanC－2、vanC－3则表达为一种低水平的万古霉素耐受性，主要分别存在于E．gallinarum，E．casseliflavns，E．flavescens中。

利用多重PCR方法同时检测肠球菌的耐万古霉素的编码基因（vanA、vanB、vanC－1、vanC－2－vanC－3），为普查肠球菌的耐药性和临床治疗提供了依据。反转录PCR（RTPCR）则可以检测出特异的vanA或vanB的mRNA，从而确定肠球菌vanA、vanB的表达情况，可以确定肠球菌耐药的表型。

三、rpoB基因突变的检测

随着多药耐药性结核分枝杆菌（MDRTB）和抗结核药物的有限，结核病已越来越严重地威胁人类的健康。利福平抗性分枝杆菌的产生是MDRTB的显著标志。结核分枝杆菌（TB）利福平抗性的产生是由于编码RNA聚合酶B亚单位的rpoB基因发生点突变所致。用基因分型的方法确定该突变费时费力，而且该方法还有赖于对所有与耐药性有关的突变的详细了解和研究。事实上，rpoB的基因型和检出率在不同地域有很大的差异。因此用基因分型的方法检出所有可能的突变有很大的难度。基于PCR方法，扩增rpoB基因并进行DNA序列分析，不仅有效，而且可大大提高检出率，其敏感性可达100%。

DNA芯片技术应该是又一种可全面地检出PCR产物中的rpoB基因突变的新方法。但由于其费用相对昂贵，操作复杂，尚难应用于临床实验室。一种固相PCR产物测序技术则相对廉价而操作简单。应用系列探针分析（line probe、assay，LiPA）则较为廉价、简单和快速。所谓LiPA，即设计一系列S探针，其碱基序列部分相互重叠，并只能与野生型rpoB杂交。另一系列R探针，其中每个R探针针对一个突变的碱基。首先用一对标记有生物素的引物扩增rpoB基因，将rPoB PCR产物与固定于膜上的S探针和R探针在合适的条件下进行杂交反应，如果rpoB基因有突变，则不能与相应的S探针杂交，并与相应的R探针发生结合，通过显色而判断出突变的有无和位点。与测序法相比，其准确性可达96．7%～100%。较核寡苷酸杂交、限制性片段长度多态分析及DNA指纹更加敏感。另一种RNA／RNA碱基错配分析技术与LiPA类似，有100%的特异性和96%以上的敏感性，而且快速、简便。

四、其他耐药基因的检测

其他耐药基因如金黄色葡萄球菌红霉素抗性基因ermA、ermB、ermC，肺炎链球菌青霉素抗性基因pbp1A、pbp2B，肠球菌庆大霉素抗性（HLGR）基因和维及霉素抗性基因SatA，厌氧菌四环素抗性基因tet（Q）等，均可用PCR或探针杂交方法获得准确可靠的检测结果。探针杂交及其改良技术、PCR－RFLP和PPCR－SSCP则更适用于点突变所致的耐药基因的检测，如结核分枝杆菌rpsL基因的突变（耐链霉素）等。