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临床化学常用分析技术

时间:2023-03-16 理论教育 版权反馈
【摘要】:1.光谱分析 利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征,来确定其性质、结构或含量的技术,称为光谱分析技术。琼脂糖凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。5.电化学分析 利用物质的电化学性质,测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法称为电化学分析法。采用酶免疫方法可对酶蛋白水平进行定量分析。危急值是指需要立即采取临床干预的测定值。

1.光谱分析 利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征,来确定其性质、结构或含量的技术,称为光谱分析技术。光谱分析技术有发射光谱分析(包括荧光分析法和火焰光度法)、吸收光谱分析(包括可见及紫外分光光度法、原子吸收分光光度法)和散射光谱分析(比浊法)。

荧光分析法可用于糖类、胺类、甾族化合物、DNA与RNA、酶与辅酶、维生素及无机离子等物质的测定。免疫比浊法可用于免疫球蛋白、载脂蛋白和补体等物质的快速测定。

2.电泳

(1)原理:在直流电场中,带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。①醋酸纤维素薄膜电泳:由醋酸纤维素制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜,该薄膜对蛋白质吸附小,能消除电泳中出现的“拖尾”现象。②凝胶电泳:以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。③等电聚焦电泳:等电聚焦(IEF)是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。④毛细管电泳:利用电泳和电渗流的电动力学原理,在空芯的微小内径的毛细管中进行混合物的高效分离技术。

(2)应用:醋酸纤维素薄膜电泳适用于病理情况下微量异常蛋白的检测。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)适用于分离蛋白质及较小分子核酸。琼脂糖凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。等电聚焦电泳适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。

3.离心 是根据一组物质的密度和在溶液中的沉降系数、浮力等不同,用不同离心力使其从溶液中分离、浓缩和纯化的方法。制备离心技术主要用于物质的分离、纯化,而分析离心技术主要用来分析样品的组成。普通离心法用来分离细胞、细胞膜或细胞碎片。差速离心法用于定性分离手段之前的粗制品提取。密度梯度离心法可同时使样品中的各个组分得到分离。

4.层析

(1)原理:利用不同物质理化性质的差异而建立的分离技术。所有的层析系统都由固定相和流动相组成。当待分离的混合物在两相中的分配(含量比)不同,且随流动相向前移动,各组分不断地在两相中进行再分配。分别收集流出液,可得到样品中所含的各单一组分,从而达到将各组分分离的目的。

(2)应用:①凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。②离子交换层析可用于分离氨基酸、多肽及蛋白质,也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。③高效液相层析用于分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等物质。④亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。

5.电化学分析 利用物质的电化学性质,测定化学电池的电位、电流或电量的变化进行分析的方法称为电化学分析法。电化学分析法有电位法、电导法和电容量分析法等。电位分析法是利用电极电位和浓度之间的关系来确定物质含量。

6.酶质量分析 利用电泳、色谱和免疫学等分析技术,直接测定酶(蛋白)质量。高效液相色谱、高效毛细管电泳、双相(二维)电泳、电喷雾-激光解析质谱等分析技术均可用于酶蛋白量的分析。采用免疫电泳、Westem Blot等方法可对酶蛋白水平进行半定量分析。采用酶免疫方法可对酶蛋白水平进行定量分析。酶免疫学测定具有方便、准确、灵敏等特点,免疫学检测法的成本较高。

7.酶活性测定 ①直接法:待测酶的酶促反应底物或产物有特征性的理化性质,通过特殊的仪器直接检测。②间接法:酶促反应底物和产物没有特征性的理化性质,通过另一个反应将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物进行检测。③化学法:在酶促反应终止后加入另一试剂与底物或产物反应,转化为有色化合物,用分光光度法检测。④酶偶联法:采用另一个或几个酶(辅助酶和指示酶)将测定酶的某一产物转化为新的产物,当其他酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时,可以用指示酶的反应速度来代表待测酶的活性。

8.工具酶及指示反应 将某一产物偶联到另一个酶促反应中,把第一步反应称为辅助反应,所用工具酶叫辅助酶,偶联的反应称为指示反应,指示反应所用的工具酶叫指示酶。

9.代谢物酶法测定 ①终点法:又称平衡法,测定反应完全后待测物或产物变化的总量。②动力学法:测定两个固定时间的吸光度差值,只要此期间待测物消耗<5%,就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度,所以动力学法有时又称为固定时间法。终点法所需工具酶多,而动力学法要求工具酶的Km足够大。终点法对仪器的电噪声和温控要求不严;动力学法要求仪器的电噪声小,吸光度应读准到0.000 1,温度变化<0.1%。产物的堆积和样品色原对动态法影响较小,而对终点测定法影响较大。用终点法测定乳糜或溶血标本有时需设样本空白。

10.临床化学方法

(1)建立根据:临床化学方法应具有实用性和可靠性两方面的性能指标。方法的建立要根据所用技术的原理和被测物质的物理化学性质来确定其方法建立的原理。实用性包括微量快速、费用低廉、应用安全。可靠性即具有较高的精密度和准确度以及较大的检测能力,包括精密度、准确度与特异性、检测能力。

(2)建立过程:①根据方法选择的要求对已发表的各种检测方法进行比较与检验,确定哪些方法有充分的科学根据及真实的使用价值。②候选方法(经初步选定的方法)确定后,要熟悉该法的原理、性能指标及相应的条件等。③进行初步试验,评价候选方法所有的性能指标。

(3)评价:①精密度评价,评价给出结果是可重复程度。②准确度评价,评价所给出的结果是否准确。③线性评价,判断对某一分析方法测得的浓度与设定的浓度之间的比例关系的范围。④干扰试验,评价方法给出的结果是否受非分析物影响及影响程度。

(4)建立后的临床观察

①参考值与医学决定水平的确定:“参考值”是指在规定人群中抽样进行测定,由此得到的均数及分布范围,作为它所代表人群的判断参考。

②医学决定水平和危急值:医学决定水平就是临床按照不同病情给予不同处理的指标阈值。危急值是指需要立即采取临床干预的测定值。

③临床病例观察:用于诊断的试验必须具备灵敏度与特异度二个基本特性,两者缺一不可。在诊断指标中以真阳性率(TP率)对假阳性率(FP率)作图,并将相对的点连接起来得到的曲线称为受试者工作曲线(ROC curve)。根据诊断试验的ROC曲线,选择合适的诊断阈值,比较两种不同诊断试验对诊断同种疾病的可靠性。

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