1．概念 酶免疫技术是用酶标记抗体（或抗原）与检测标本中的相应抗原（或抗体）特异性结合，利用酶催化底物反应的生物放大作用显示免疫复合物的存在，提高检测抗原－抗体复合物敏感性的一种免疫标记技术。酶免疫技术包括酶免疫组化技术和酶免疫测定。
2．酶和酶作用底物 在ELISA中一般常采用辣根过氧化酶（HRP），其次是碱性磷酸酶（AP）。
辣根过氧化酶（HRP）主要催化DH2＋H2O2→D＋2H2O反应，在反应中，H2O2是受氢体底物，DH2是无色的供氢体底物，在HRP的催化下脱氢而显色。
许多化合物可作为HRP的供氢体底物。在ELISA中应用最多的底物是邻苯二胺（OPD），显棕黄色，灵敏度高，比色方便；缺点是配成应用液后稳定性差，而且有致癌性。此外还有四甲基联苯胺（TMB），经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加硫酸停止反应后变黄色，可在比色计中定量；而且稳定性好、无致癌性。
3．酶标记抗体或抗原 酶标记的抗体或抗原称为结合物，制备抗体酶结合物的方法常用戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
（1）戊二醛交联法：戊二醛可以使酶与蛋白质的氨基偶联，方法有一步法和二步法。
一步法是将HRP与Ig在戊二醛的作用下同时反应连接；二步法则先将HRP与戊二醛作用，形成HRP－戊二醛结合物，然后透析除去多余的戊二醛，在pH 9．5缓冲液中再与Ig作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。
（2）过碘酸盐氧化法：此法只用于HRP与蛋白交联，HRP含18%糖类，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基，由于醛基很活泼，可与Ig结合形成酶标结合物。
（3）标记抗体的最佳用量通常采用棋盘滴定法进行滴定。
4．固相载体 最常用固相载体的是聚苯乙烯。聚苯乙烯为塑料，具有较强蛋白质吸附性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后能保留原来的免疫活性。其他载体还有微孔滤膜（如硝酸纤维素膜、尼龙膜等）和含铁磁性微粒。
5．免疫吸附剂 将抗原或抗体固相化的过程称为包被，而被固相化的抗原或抗体称为免疫吸附剂。
为避免由于免疫吸附剂（抗原或抗体）浓度过低而不能完全覆盖固相载体表面，可能使其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也吸附于固相载体表面，产生非特异性显色而导致本底偏高，应在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，以消除这种干扰，这一过程称为封闭。
6．酶免疫技术分类
（1）酶免疫组化技术：用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位；如酶作用的产物电子密度发生一定的改变，则可用电子显微镜观察，称为酶免疫电镜技术。
（2）酶免疫测定（EIA）：用于液体标本中抗原或抗体的测定。
酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合酶标记物与游离酶标记物而分为均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。
①均相酶免疫测定：均相酶免疫测定属于竞争结合分析方法，例如酶增强免疫测定技术（EMIT），其基本原理：将标准半抗原与酶结合成酶标半抗原，半抗原与酶活性均不变。当酶标半抗原与相应抗体特异结合后，由于半抗原与抗体接触太紧密，使抗体分子在酶活性中心形成空间位阻，阻隔酶与底物结合，标记酶的活性被抑制。当样品中的待测半抗原与标准半抗原同质时，待测半抗原与酶标半抗原竞争结合抗体，待测半抗原浓度越高，游离的酶标半抗原就越多，酶活性就越高，即反应后酶活性与标本中的半抗原量呈正比。由于在抗原抗体反应后结合态标记酶失去活性，因此不需要分离结合态酶（Ag－Ab－E）与游离态酶（Ab－E或Ag－E），直接测定游离态酶的活性变化，即可推算出标本中的Ag含量。
均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。
②异相酶免疫测定：异相法又根据反应介质的物理状态分为液相酶免疫测定和固相酶免疫测定（如常用的ELISA）。
异相酶免疫测定原理：在抗原反应后，先分离结合酶标抗体（E－Ab－Ag）与游离酶标抗体（E－Ab），然后测定E－Ab－Ag或E－Ab中的酶活性，推算出标本中的抗原量。
7．酶联免疫吸附试验（ELISA）
（1）基本原理：将抗原（或抗体）吸附在聚苯乙烯反应板上后，加入酶标抗体（或酶标抗原）与相应抗原（或抗体）特异结合，使酶也结合到载体上，洗去游离酶标抗体（或酶标抗原），加入底物显色，根据颜色有无和深浅进行定性或定量分析。
因此用ELISA方法测定样品，三种必要的参与物分别是固相抗原（或抗体）、酶标记抗原（或抗体）和底物。
（2）检测方法类型及反应原理
①双抗体夹心法：未标记固相诊断抗体与待检抗原反应后，加酶标诊断抗体，反应后加底物显色。颜色深浅与待测抗原量成正相关。
②双位点一步法：应用针对同一抗原分子上的两个不同抗原决定基的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体，在测定时可同时加入标本和酶标抗体（两步并作一步）。显色反应后颜色深浅与待测抗原量成正相关。但要注意，如果标本中抗原含量过高，会出现钩状效应，可能影响结果的准确性。
③间接法测抗体：固相已知标准抗原与待检抗体反应后加酶标羊抗人IgG抗体，反应后加底物显色。颜色深浅与待测抗体量成正相关。
④竞争抑制法：竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
以测定抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争结合固相抗体，结合于固相的酶标抗原量与待测抗原的量呈反比，显色反应后颜色深浅与待测抗原量成负相关。
⑤捕获法测IgM抗体：固相羊抗人IgM抗体与受检标本（含IgM）反应后，加已知标准抗原参与反应，再加针对标准抗原的酶标抗体，反应后加底物显色。如有颜色显示，则表示孔中有“羊抗人IgM抗体－IgM－Ag－酶标IgG”复合物存在，即血清标本中有针对标准抗原的特异性IgM存在，是为阳性反应。颜色深浅与待测IgM量成正相关。
⑥应用亲和素和生物素的ELISA：把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，可大大提高ELISA的敏感度。
8．斑点酶免疫吸附试验 斑点－ELISA（dot－ELISA）的原理：以蛋白质吸附能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体，在膜上点加样品抗原，与酶标抗体反应后在固相膜上形成有色沉淀。
9．免疫印迹法（IBT） 免疫印迹法分三步进行，即样品蛋白SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳、电转移和酶免疫定位。
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