细菌的培养与分离技术

（一）细菌培养的基本条件

1．细菌实验室 ①实验室应安装严密的门窗；②室内应安装紫外灯，工作开始前照射20min；③室内应备有消毒剂，同时备有供手部消毒用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及水源等；④操作台须每日用消毒剂擦洗，地面每周至少用消毒剂擦洗1次；⑤标本、无菌器具、用过的物品等分开放置，对用过的物品及时进行灭菌处理；⑥配备空调设备和消防设备。

2．无菌实验室 ①完全封闭，人员出入通道设两道门，其间为缓冲区；②使用前以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸进行彻底消毒；③无菌室内一般分装无菌的培养基及接种传染性强的细菌；④操作人员应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩；⑤也可用超净工作台进行相关操作，超净工作台应选择垂直气流通风方式；⑥配备空调设备。

3．基本设备和器具 ①恒温培养箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；②显微镜；③高压蒸汽灭菌器、干烤箱；④冰箱和冷藏柜；⑤接种器具，包括接种环和接种针；⑥pH计；⑦火焰灯或酒精灯；⑧其他各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿以及离心机、天平等。

（二）细菌的接种与分离技术

决定接种方法的因素有标本来源、培养目的及所使用培养基的性状。

1．平板划线分离法 使标本中混杂的多种细菌在培养基表面分散生长，形成各自菌落，以便根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。常用的有：①连续划线分离法；②分区划线分离法：用于杂菌量较多的标本。一般分为四个区，将标本均匀涂布于第一区，约占平板1／5面积，再在二、三、……区依次连续划线。每划完一区，接种环灭菌一次。每一区的划线均接触上一区的接种线1～2次，使菌量逐渐减少以获得单个菌落。

2．斜面接种法 主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。用灭菌接种环取少许细菌或单个菌落，从斜面底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到顶端。

3．液体接种法 多用于液体生化管的接种以及增菌培养。用灭菌接种环取少许菌，在液面试管与内壁交接处的管壁上轻轻研磨，使细菌与培养液混合。

4．穿刺接种法 常用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。多用于菌种保存，细菌动力观察和细菌某些特性的观察等。用灭菌接种针取少许细菌，从半固体培养基中央垂直刺入，接近管底但不可接触管底，然后接种针沿原路退出。

5．倾注平板法 常用于测定牛乳、饮水和尿液等标本的细菌数。将标本经适当稀释后，取一定量加入已灭菌平皿内，倾入已溶化并冷却至45℃的培养基，混匀，待凝固后倒置培养，根据培养基内的菌落数和稀释倍数计算出标本的细菌数。

6．涂布接种法 常用于纸片法药敏测定，也用于细菌计数。加定量被检菌液于平板表面，用灭菌L型玻璃棒反复涂布使其均匀分布在琼脂表面，贴上药敏纸片培养并观察结果。

（三）细菌培养的方法

1．需氧培养法 适用于需氧和兼性厌氧菌的培养。将已接种好的平板、斜面、液体培养基，置于35℃温箱中孵育18～24h，一般细菌即可生长。

2．二氧化碳培养法 有些细菌在初次分离培养时，须在5%～10%CO2的环境下才能生长良好，如流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、牛布鲁菌等。二氧化碳培养方法主要有：①二氧化碳培养箱：适用于大型实验室应用；②烛缸法；③化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0．4g和浓盐酸0．35ml的比例，分别置于容器内（如平皿内）。将容器连同已接种的培养基放入干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使碳酸氢钠与浓盐酸接触生成CO2。

3．厌氧培养法 适用于兼性厌氧菌和专性厌氧菌培养。①厌氧罐法；②气袋法；③厌氧手套箱法；④庖肉培养基法；⑤焦性没食子酸法。

（四）细菌的生长现象

1．分离培养基上菌落的生长现象

（1）观察菌落的表面特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和黏度等。菌落一般分为光滑型菌落、粗糙型菌落和黏液型菌落。

（2）血琼脂上的溶血。①α溶血：草绿色溶血环；②β溶血：透明溶血环；③γ溶血：无溶血环；④双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。

（3）气味。有些细菌在平板上生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、白假丝酵母菌（酵母味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌（泥土味）等。

2．细菌在液体培养基中的生长现象 ①大多数细菌生长繁殖后呈现均匀浑浊；②少数链状细菌，如炭疽芽胞杆菌、链球菌等则为沉淀生长；③结核分枝杆菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。

3．细菌在半固体培养基中的生长现象 半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌在穿刺线的两侧均可见有浑浊或小菌落。

（五）细菌L型的检查

培养的L型细菌菌落常出现油煎蛋样菌落（典型L型菌落）、丝状菌落（F型）和颗粒型菌落（G型）三种类型。生物学特性为形态多形性、染色不确定性、渗透压敏感性，可滤过性、生化反应减弱特性以及对β内酰胺类等细胞壁抗生素的抵抗性。

1．标本采集与培养方法 血液、胸腹腔积液、尿液标本及其他穿刺液标本，应立即送检。粪便、阴道分泌物等易污染标本，可用无菌生理盐水稀释后用滤膜过滤，取滤液接种。若标本不能及时接种，应加入20%蔗糖无菌溶液或高渗肉汤增菌培养基。标本应先接种高渗肉汤增菌，出现浑浊或沉淀后，再转种L型平板和血平板37℃培养2～7d。L型菌在L型平板的典型菌落为“油煎蛋”样，但患者标本中新分离菌落常不典型，多呈颗粒状菌落，染色呈多形性。必要时需传代返祖进一步鉴定。

2．检验报告 ①血平板无菌落生长，L型平板有菌落生长，可报检出L型菌；②血平板中菌落细小，不易刮下。细菌呈多形性，细胞壁有缺损，L型平板中有菌落生长，可报检出L型菌；③血平板及L型平板均有菌落生长。细菌有原菌及L型两种形态，可报告细菌型及L型同时存在，并做药敏试验。