厌氧性细菌及其检验

（一）概述

厌氧菌是一大群在有氧环境中不能生长，必须在无氧条件下才能生长的细菌。根据是否形成芽胞分为两大类，一类是革兰染色阳性有芽胞的厌氧芽胞梭菌（梭状芽胞杆菌属）；另一类是无芽胞的革兰阳性及革兰阴性球菌与杆菌。据耐氧性分三类：①专性厌氧菌：又分为极度厌氧菌（氧分压＜0．5%，空气中暴露10min致死）和中度厌氧菌（氧分压为2%～8%，空气中暴露60～90min能生存）；②微需氧菌：能在含5%～10%CO2环境中的固体培养基表面生长的细菌；③耐氧菌：其耐氧程度刚好能在新鲜配制的固体培养基表面生长。

（二）临床意义

梭状芽胞杆菌属引起外源性感染，在一定条件下无芽胞厌氧菌可引起内源性感染，在临床厌氧菌感染中，由正常菌群引起的内源性感染远多于外源性感染。有些部位的感染如脑脓肿、牙周脓肿和盆腔脓肿等80%以上是由厌氧菌引起的；其中部分由厌氧菌单独引起，大部分与需氧菌、兼性厌氧菌共同引起混合感染。

厌氧菌感染的危险因素：①局部组织的氧化还原电势降低；②机体免疫功能下降；③某些手术及创伤；④长期应用抗菌药物；⑤深部需氧菌感染。

厌氧菌感染的临床及细菌学指征：①感染局部有气体产生；②发生在黏膜附近的感染；③深部外伤后的继发感染；④有特殊的分泌物；⑤某些抗生素治疗无效的感染；⑥胃肠道手术后发生的感染；⑦分泌物涂片革兰染色镜检发现有细菌，而培养阴性者，或在液体及半固体培养基深部生长的细菌，均可能为厌氧菌感染。

（三）标本采集与运送

标本采集与送检必须注意两点：标本绝对不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。

1．标本采集 用于厌氧菌培养的标本多采用特殊的采集方法，如针筒抽取等，应从无正常菌群寄居的部位采集，凡含有正常菌群的标本，如齿龈和鼻咽拭子、咳痰、接近皮肤或黏膜的分泌物、自然排出的尿液、阴道分泌物、粪便以及洗胃液等，均不宜做厌氧菌培养，厌氧培养最理想的检查材料是组织标本。

2．标本运送 标本采集后应尽快送检，常用于运送厌氧菌标本的方法有：①针筒运送法；②无菌小瓶运送法；③厌氧罐或厌氧袋运送法；④棉拭子运送法：一般不采用，如果使用该方法，一定使用特制运送培养基。标本送到实验室后，为防止标本中的兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2h。如不能及时接种，可将标本置室温保存。

（四）微生物学检验

1．直接镜检 根据形态和染色性，结合标本性状与气味作出初步估计，便于选择合适的培养基和培养方法及验证培养结果。

2．分离培养

（1）初代培养

①培养基的选择：根据镜检结果选择使用非选择培养基和选择培养基。a．非选择培养基：强化血琼脂平板，其营养丰富，几乎能培养出所有的厌氧菌。b．选择培养基：几乎所有的厌氧菌都有其专用的选择培养基。c．注意：使用新鲜（2～4h）和预还原24～48h培养基及采用预还原灭菌法制作的培养基（用前于培养基中加入L－半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等还原剂）；液体培养基应煮沸10min迅速冷却，立即接种。

②标本接种：标本应同时接种固体和液体两种培养基，每份标本应同时接种3个平板，分别置有氧、无氧和含5%～10%CO2环境培养。

③厌氧培养法：方法有厌氧罐培养法、厌氧气袋法、气体喷射法和厌氧手套箱培养法。常用亚甲蓝和刃天青指示厌氧状态，无氧时均呈无色，有氧时亚甲蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。

④结果观察：至少培养48h后才开始观察，如疑为放线菌则应延长至72～96h。若标本镜检阳性，但培养48h后无菌生长，应继续培养5～7d，同时从液体培养基再转种平板培养。

（2）次代培养和厌氧菌的确定：初代厌氧培养有细菌生长时，为确定其是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。细菌在需氧和厌氧培养均能生长，为兼性厌氧菌；在需氧和厌氧培养生长不好，但在含5%～10%CO2生长良好，为微需氧菌；只在厌氧环境中生长即为专性厌氧菌。

3．鉴定 依据菌体形态、染色和菌落性状以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定，常用的抗生素有卡那霉素及甲硝唑。卡那霉素可用于梭杆菌属（敏感）与类杆菌属（多数耐药）的区分，甲硝唑用于厌氧菌（敏感）与非厌氧菌（不敏感）的区分。