铁离子在脑损害中的作用及铁螯合剂的应用前景

出血性脑血管病及各种颅脑损伤是神经外科的临床常见病，常合并有脑组织出血，凝血酶与早期损伤有关，溶解红细胞则被认为与脑出血后迟发性损伤相关。溶解红细胞可引起脑组织超氧化物歧化酶（SOD）的变化和细胞蛋白质、DNA的氧化损伤。目前认为血红蛋白的降解产物更可能与组织毒性作用相关。血红蛋白在血红素加氧酶－1（HO－1）作用下被降解生成Fe2＋、胆绿素和CO。而铁离子介导的氧化损伤和细胞凋亡在脑出血继发性脑损伤机制中起重要作用。运用铁离子螯合剂可以减轻脑组织损伤。本章就目前国内外有关脑内铁代谢的特点、脑出血后与铁有关的脑组织损伤机制及有关试验研究加以叙述。

（一）铁的分布、功能、有关铁转运的蛋白及脑铁转运机制

1．铁元素在脑组织中的分布和功能 铁元素广泛存在于脑的各个部位，苍白球，黑质，和齿状核浓度较高，基底神经节铁的浓度最高。在大脑皮质中，运动区的大脑皮质要比其他的皮质区浓度高，在细胞水平，脑内各种细胞均含有Fe，而少突神经胶质细胞含Fe最多。脑内铁有着重要的生理功能：传递电子，参与三羧酸循环、线粒体氧化反应和氧运输，并参与DNA、RNA、蛋白质、脂质和胆固醇合成，以及神经髓鞘的发生与发展。铁离子还作为酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶的协同因子，参与γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）能神经元的活动。

2．与脑铁转运相关的蛋白 人脑中存在多种与脑铁转运相关的蛋白：①血红蛋白（Hemoglobin，Hb）在红细胞中Fe2＋与血卟啉在线粒体内经铁螯合酶形成血色素，然后被转运出线粒体与珠蛋白结合成血红蛋白，发挥运输氧的功能。②铁蛋白（ferritin，Fn）广泛分布于各种组织细胞内，用于储存铁及铁的解毒。③转铁蛋白（transferrin，Tf）和转铁蛋白受体（trans－ferrin receptor，TfR）：成年人脑内的Tf主要来源于少突胶质细胞和脉络丛，与脑脊液和细胞外间隙中的铁离子结合，TfR主要存在于管腔侧内皮细胞和神经元中。Tf与内皮细胞TfR结合，使铁离子被释放进入内皮细胞，而Tf则被释放重新进入循环。④铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CP）是一个重要的亚铁氧化酶，在Fe3＋形成过程中是必不可少的，生理状态下可以催化Fe2＋氧化为Fe3＋，帮助铁与转铁蛋白相结合，因为只有Fe3＋可与转铁蛋白结合，因而CP对机体铁转运和铁平衡起着重要作用。⑤毛细血管内皮细胞中存在黑色素转铁蛋白（melanotransferrin，MTf）既能与细胞膜结合，也能以可溶性形式存在。⑥二价金属转运体（divalent metal transporter 1，DMT1）在人体组织中分布广泛，可介导铁离子从肠腔被吸收入肠上皮细胞以及铁离子从细胞内释放，能够影响脑铁离子的摄取。⑦膜铁转运蛋白（ferroportin）在脑内神经元，星形胶质细胞，血管内皮细胞，脉络丛广泛表达，与通过血脑屏障摄取铁离子有关。其他如膜铁转运辅助蛋白、乳铁蛋白受体、肠细胞色素B（DCb）、膜铁转运辅助蛋白等均有可能参与脑铁代谢的平衡。

3．脑铁转运机制

（1）铁通过血脑屏障的机制：通过经典的转铁蛋白（transferrin，Tf）和转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）途径铁被脑外的许多组织细胞吸收。血脑屏障（blood－brain barrier，BBB）的存在使脑组织不能直接从血液中获取铁。铁必须首先通过血脑屏障，然后才能被脑细胞摄取及利用。众多证据显示转铁蛋白－转铁蛋白受体转运系统是铁跨越脑组织毛细血管内皮腔膜的重要途径。大多数血浆铁主要以转铁蛋白结合铁的形式从血液进入脑毛细血管内皮细胞。该过程包括结合、胞吞、酸化和解离、移位及细胞内转运。首先是血清转铁蛋白运载铁到血脑屏障，然后与血脑屏障内皮细胞膜上转铁蛋白受体结合，经过转铁蛋白受体介导的胞吞形成胞吞小体。由胞吞小体膜上H＋泵的作用使胞吞小体内pH下降至5．5～6．5，由此导致铁与转铁蛋白解离并还原至Fe2＋。再经由二价金属转运体介导Fe2＋跨越胞吞小体膜移位进入脑毛细血管内皮细胞胞质内。在pH 7．4环境条件下，转铁蛋白和转铁蛋白受体解离回到血液循环之中。另外，乳铁蛋白一转铁蛋白同族体与Fe3＋结合后可刺激发生胞吞作用，转运铁离子进入内皮细胞。Burdo等研究表明除转铁蛋白依赖的转运途径外，尚存在非转铁蛋白依赖的转运途径。

（2）脑内铁转运和脑细胞铁摄取：在通过血脑屏障之后，铁有两种转运形式：Tf－Fe和非Tf结合铁（nontransferrin－bound iron，NTBI）：一部分铁与脑内少突胶质细胞和脉络从上皮细胞分泌的内源性Tf迅速结合成为Tf－Fe，另一部分铁则与其他转运物质结合成为NTBI。在脑脊液（CSF）和脑细胞间液中由于铁的浓度超过Tf结合铁的能力，而Tf与铁的亲和力远高于其他的铁转运体，所以脑脊液和脑细胞间液中的铁（如果是Fe3＋的形式）首先与Tf结合以致Tf完全饱和，剩余的铁则与其他转运体结合，成为NTBI。NTBI可能包括柠檬酸－Fe3＋（或Fe2＋）、维生素C－Fe2＋和白蛋白－Fe2＋（或Fe3＋），以及乳铁蛋白Lf－Fe3＋和分泌型色素转铁蛋白p97－Fe3＋。但也可能存在少量的游离Fe2＋。Tf－Fe3＋、Lf－Fe3＋和分泌型p97－Fe3＋分别通过转铁蛋白受体、乳铁蛋白受体和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚型p97介导的过程被相应的脑细胞摄取。NTBI可能通过DMT1或三价阳离子转运体（trivalent cation－specific transporter，TCT）介导的机制被神经元或其他型脑细胞摄取。Connor等研究发现DMT1在人大脑皮质、脉络丛和室管膜细胞大量分布：在大脑皮质中DMT1在血管内皮细胞和与血管紧密联系的星形胶质细胞表达强烈，人脑的石蜡切片显示脉络丛的内皮细胞中DMT1强烈表达，脑室壁的室管膜细胞DMT1均一表达，DMT1的反应产物集中在脑室附近表明它对脑室铁转运可能有重要作用。

此外，近年研究发现铜蓝蛋白可能在脑神经元铁摄取的过程中起重要作用，在二价铁离子（铁通过血脑屏障基底膜的主要形式）通过血脑屏障血管基底膜后，大部分可能必须通过铜蓝蛋白的作用将其氧化为三价铁（少量的则可能通过自发氧化反应被氧化）。形成的三价铁才能与脑脊液和细胞间液中的转铁蛋白（由少突胶质细胞和脉络丛内皮细胞合成分泌）结合通过转铁蛋白受体介导的胞吞途径被神经元（或小胶质细胞和其他相关的脑细胞）所摄取。

（二）脑出血后脑铁离子超载与脑损伤机制

动物研究证实，血红蛋白降解的主要产物铁离子在脑出血后的继发性损害包括继发性脑水肿和神经元毒性损害中发挥关键作用，铁在血肿处的高浓度促使了急性脑水肿（第1周）的形成，以及迟发性脑萎缩（1个月后）的发生。

1．铁离子与HO－1持续增高是迟发性水肿发生的重要原因 血肿周围铁离子与HO－1持续增高可能是脑出血3d后发生迟发性水肿的重要原因。脑出血后脑内HO－1表达上调，使血红素分解为CO、Fe2＋和胆绿素的速度加快。Wu等（2003）以SD大鼠为研究对象观察到脑出血1d时在血肿周围区域即可发现铁离子阳性细胞；3d时，红细胞溶解后产生的非血红素铁开始在脑内增加；7d后稳定于一个高水平，这种高水平状态至少维持到第28天。脑出血后，非血红素铁在鼠脑出血侧可增加至3倍，过量自由铁聚集导致脑损伤，脑基底神经节细胞中的Na＋和K＋聚积。皮质下注射铁离子，发现可以导致试验鼠癫样发作和脑水肿。研究表明，当红细胞开始溶解时，血色素的降解导致铁的释放，局部铁的集中可以达到10mmol／L的浓度，进而导致严重的脑水肿，而低浓度（例如0．2mmol／L）的Fe2＋即可造成脑组织损害。

2．脑内铁超载通过多种途径引起脑损伤 脑内铁超载可通过多种途径引起脑损伤，其中研究较多的是经过脂质过氧化形成自由基，造成脂质、蛋白质和DNA的过氧化损伤。在正常情况下，细胞能量代谢、儿茶酚胺和花生四烯酸（AA）代谢以及吞噬作用时均可产生氧自由基，但体内有抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶、维生素C等，可有效清除自由基，使细胞免受氧化性损害。但当脑出血后血红蛋白分解释放出来大量的游离铁后情况不同了，铁离子可以通过Fenton反应，激发产生大量羟基自由基，从而引发并加剧了组织氧化，造成脂质、蛋白质和DNA的损伤，同时因为有游离铁的存在而使其反应程度放大，细胞膜受攻击而丧失流动性和膜电位，膜的渗透性增加，Na＋－K＋－ATP酶活性降低，细胞膜上的受体和离子通道被破坏；在自由基的作用下，胞质及膜蛋白及某些酶可交联成二聚体或更大的聚合物，使蛋白结构改变，失去功能；染色体畸变，核酸碱基改变或DNA断裂，最终导致细胞死亡。有研究显示，铁离子可以替换SOD中的锰离子，直接引起其活性的降低。SOD活性的降低，可能又进一步加剧了过氧化损伤。Liddell等观察到谷胱甘肽过氧化物酶缺乏的小鼠的星形胶质细胞对H2O2的清除率比正常小鼠的星形胶质细胞慢，正常的星型胶质细胞在H2O2处理后2min，细胞内的谷胱甘肽就可迅速升高到总量的60%，以H2O2处理后再培养发现，酶缺乏的星形胶质细胞有45%在8h内死亡，而正常的星型胶质细胞没有影响，如果在以H2O2处理前降低两种细胞细胞内的谷胱甘肽含量会导致两类细胞活力大幅度降低。

3．DNA损伤的两条途径 DNA损伤至少可以通过核酸内切酶介导的DNA断裂和氧化损伤两条途径。通过对8－羟基－2－脱氧鸟苷（8－hydroxyl－2－deoxyguanosine，8－OHdG）的检测和脱嘌呤／脱嘧啶（apurinic／apyrimidinic）位点的数量可以评估在脑水肿周围区域DNA链断裂情况。DNA的脱氧鸟苷残基能够被多种产生自由基的物质羟化，产生8－OHdG（DNA氧化损伤的标记之一）。ICH后24h没有检测到8－OHdG，然而3d后检测的到，7d后8－OHdG在同侧基底神经节大量表达。而脑出血的对侧基底神经节没有表达，另外在假手术组也没有表达。另外，DNA修复酶APE／Ref－I负责修复DNA的脱嘌呤／脱嘧啶位点，脑出血后，脱嘌呤／脱嘧啶位点数量在同侧基底神经节早在从ICH后24h开始增加，第3天达峰值并持续到第7天。

羟基自由基能够引起DNA链断裂，断裂的DNA链不断修复，而参与DNA修复的酶也同时受到自由基的攻击，因此修复过程可能会出现编码的错误，导致细胞凋亡。在原代培养的大鼠小脑颗粒细胞中，应用200μmol／L FeSO4处理36h，细胞存活力下降到43．6%，而凋亡细胞增加到50．6%，透射电子显微镜检测发现神经元中有破裂的核包膜和浓缩的染色质。这些均提示铁离子在脑出血后脑组织损伤中是起重要作用的。

4．脑出血后会发生脑萎缩 大鼠实验证实脑出血后脑萎缩逐渐发展，在1～2个月或以后达到顶峰，产生原因尚不清楚。脑萎缩和神经功能障碍是相联系的，使用去铁胺可以减轻脑萎缩，改善鼠脑神经功能。

（三）铁螯合剂药物特点及其在脑出血动物模型中的研究进展

铁螯合剂与体内铁离子结合有效地提高铁的排泄，在某种程度上阻止了铁参与氧自由基的形成，通过与铁离子形成无活性的络合物，干扰Fenton反应，减少羟自由基生成，从而阻断脂质过氧化，对神经细胞可起到保护作用。目前铁螯合剂在脑出血方面的研究大多文献都是有关去铁胺（去铁敏，除铁灵，desferrioxamine，DFO）的。

去铁胺是六齿状水溶性铁螯合剂，由于其螯合特性，无论是游离的、或者与铁蛋白及含铁血黄素结合的铁离子，去铁胺均能与之结合形成铁草胺（一种性质稳定的水溶性铁胺螯合物），由于铁胺可完全排出，去铁胺可促进铁从尿液和粪便中排泄，并因此减少铁在器官中的病理性沉积。然而，去铁胺不能从转铁蛋白、细胞色素、肌红蛋白、血红蛋白或其他含有血红素的物质中去除铁离子，对Fe2＋的亲和力很低。去铁胺与Fe3＋以1∶1比例结合，理论上100mg DFO能结合8．5mg Fe3＋。

去铁胺药代动力学：去铁胺经肌肉或皮下注射后，吸收迅速，但是由于完整黏膜的存在，胃肠道的吸收不好（如果将去铁胺加入透析液中，则可在腹膜透析期间吸收）。按10mg／kg体重计算给健康志愿者肌内注射去铁胺后30min，血浆浓度达到高峰，为15．5μmol／L，注射后1h，铁胺的峰浓度为3．7μmol／L。健康志愿者的研究表明，去铁胺和铁胺均呈双相清除。在第一期（快速），去铁胺的半衰期为1h，铁胺为2．4h；在第二期（缓慢），两者的半衰期均为6h。在6h注射期间，尿中去铁胺含量占注射剂量的22%，铁胺占1%。

当铁蛋白水平低于1 000ng／ml，去铁胺的毒性反应有增加的可能性。已经报道的不良反应：局部反应，如输注或注射处疼痛、肿胀、硬结、红斑、烧灼、瘙痒、斑丘疹及皮疹，偶尔伴有发热、寒战和不适；过敏罕见；特殊感觉如视物模糊、视力下降、视力丧失、视觉障碍、夜盲症，视野缺损、视神经炎、耳鸣、听力丧失等罕见；皮肤全身性皮疹、瘙痒、荨麻疹罕见；内分泌系统如生长迟缓等罕见；呼吸系统成人呼吸窘迫综合征有个例报道；中枢神经系统有神经系统功能紊乱，头晕、抽搐，感觉异常等；胃肠道如恶心、呕吐、腹泻等罕见；肝、肾功能受损、耶尔森菌属感染及真菌感染有个例报道；此外尚有低血压、腿痉挛、骨痛、脊椎和干骺端变性等。

动物实验中去铁胺能够通过血脑屏障进入脑实质内并达到很高的浓度，除了能通过螯合作用清除铁离子外，也可以直接清除自由基，减轻Na＋－K＋－ATP酶活性受抑制程度以及提高脑的耐受性。2004年，Nakamura等人采用SD大鼠脑出血模型，发现DFO可减轻脑水肿和神经细胞凋亡；2006年，Wan等研究发现脑出血后去铁胺减少了脑脊液中游离铁的含量，同时观察到去铁胺也改善了脑出血后所导致的神经功能障碍，其他学者的相关研究也证实了去铁胺可以明显减轻脑出血介导的DNA损伤。

我们采用已建立的大鼠实验性脑室出血后慢性脑积水模型，并给予铁离子螯合剂－去铁胺做治疗对比，观察对大鼠实验性脑室出血后慢性脑积水的疗效。以28d大鼠前囟后0．4mm冠状面的侧脑室宽度评价脑积水的形成。依此标准：侧脑室注血组28d时15只大鼠中11只发生脑积水，发生率73%；侧脑室注血加去铁胺组28d时15只大鼠中4只发生脑积水，发生率27%，侧脑室注血组明显高于侧脑室注血加去铁胺组（P＜0．05），说明使用去铁胺可以有效减少大鼠脑室出血后的脑积水发生率。

我们同时还观察到侧脑室注血组大鼠7d后出现含铁血黄素侧脑室壁沉积，而在侧脑室注血加去铁胺组则没有出现。含铁血黄素的沉积是由于脑脊液中铁离子含量超过脑脊液中铁蛋白的结合能力而产生的，临床上见到的中枢神经系统含铁血黄素沉积症、肺脏含铁血黄素沉积症都是过多的铁引起器官损伤的。我们曾给予大鼠侧脑室注入高浓度的铁离子成功诱发了大鼠脑积水，说明铁离子可以诱发大鼠脑积水形成。有研究表明脑出血后脑脊液中铁离子含量可在28d时仍然高于正常6倍（6．2±1．1μmol vs 1．1±0．4μmol），而蛛网膜下腔出血后脑脊液中铁离子含量更可高达10倍以上（27．9±3．9μg／dl vs 2．3±0．7μg／dl），所以，有学者认为铁离子参与了脑室出血后脑室壁白质损伤。这提示我们：铁离子在脑室出血后脑积水的发生过程中有重要作用，去铁胺对大鼠脑室出血后脑积水的治疗结果可能是通过多种机制在起作用，但清除了脑脊液中部分铁离子是其机制之一。

（四）展望

综上所述，出血性脑血管病及各种颅脑损伤可造成不同程度脑组织出血，血红素代谢出的铁离子会对脑组织会产生重大负面影响，但可利用铁螯合剂减轻铁离子造成的损害（同时还应注意观察铁螯合剂使用过程中的不良反应），这为临床选择适当的铁螯合剂治疗脑出血和改善脑出血预后提供了一种可行的处理办法。而应用去铁胺去除脑脊液中铁离子可有效降低脑室出血大鼠脑积水的发生率，这对于预防和减少各种颅脑创伤，自发性脑出血后继发的慢性脑积水具有重要意义。