新生儿溶血病血型血清学检查

1．检验目的

检测孕妇产前与其丈夫ABO及Rh血型相容性、孕妇IgG抗体效价、产后新生儿体内不相容抗体存在情况、新生儿与产妇之间血型相容性，为新生儿溶血病的预防、诊断及治疗提供可靠的实验室依据。

2．检验原理

新生儿溶血病是由母婴血型不合,母亲体内与新生儿红细胞抗原不配合的IgG性质的血型抗体进入新生儿体内，破坏新生儿或胎儿红细胞而引起，可发生在胎儿期和新生儿早期，溶血严重者可出现死胎而流产，存活者则有不同程度的新生儿黄疸。新生儿溶血病产前诊断方法主要包括检测胎儿父母的ABO及Rh血型、孕妇不规则抗体筛查、外周血抗A/抗B或Rh抗体效价来判断新生儿溶血病发生的可能性及严重程度；新生儿溶血病产后诊断主要包括母子ABO及RhD血型鉴定试验、新生儿标本三项试验，为临床诊断及进一步采取治疗手段提供可靠的依据。

3．适用范围

适用于新生儿溶血病产前、产后血型血清学试验。

4．设备性能参数

参见KA-2200血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生Othro Biovue 离心机及各全自动血型/配血系统使用说明书。

5．器材与试剂

5.1 器材：B 600-A型低速离心机、KA-2200血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生Ortho Biovue 离心机、塑料软试管、塑料硬质试管（75 mm×12 mm）、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、移液枪、一次性移液枪头。

5.2 试剂：Diana DG Gel ABO-CDE血型卡、DiaMed ABO/RhD血型卡、Othro Biovue ABO/RhD血型卡、抗A、抗B血清、Rh分型血清、生理盐水、抗人球蛋白试剂（市售单克隆）、抗体筛查试剂红细胞、抗体鉴定试剂红细胞、致敏的阳性对照细胞（自制）。

6．标本要求

6.1 夫妇标本：EDTA-K3或EDTA-K2抗凝全血≥3 ml（手工操作时也可以使用不抗凝标本），经B 600-A型离心机1 760 r/min离心5 min，离心后无溶血及明显乳糜；

6.2 患儿标本：EDTA-K3或EDTA-K2抗凝全血≥3 ml（手工操作时也可以使用不抗凝标本），经B 600-A型离心机1 760 r/min离心5 min，离心后无明显乳糜。

7．校准步骤

参照KA-2200血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生Othro Biovue离心机及各全自动血型/配血系统使用说明书中的校准要求执行。

8．操作程序

8.1 产前检查血清学检查

8.1.1 取夫妇全血标本分别测定ABO血型及RhD血型，具体操作参照《ABO及RhD血型鉴定试验标准操作规程》；

8.1.2 夫妇ABO血型不配合时，做孕妇血清抗体检查：

8.1.2.1 IgG抗A（B）或Rh血型抗体效价测定：参照《ABO及Rh血型抗体效价测定试验标准操作规程》；

8.1.2.2 中和孕妇血清作交叉试验：用DTT或2-Me破坏母血清中IgM抗体，以此处理后血清与其丈夫细胞做凝聚胺法或IAT的交叉配血试验，如果出现阳性则可能引起HDN。

8.2 产后血清学检查操作规程

8.2.1 ABO新生儿溶血病血型血清学检查

8.2.1.1 母子标本的ABO血型鉴定　分别取产妇、新生儿的洗涤红细胞鉴定ABO血型，具体操作参照《ABO及RhD血型鉴定试验标准操作规程》。

8.2.1.2 新生儿标本的三项试验

8.2.1.2.1 直接抗人球蛋白试验　将新生儿红细胞用生理盐水充分洗涤3遍，最后一遍将上清控干，然后加1滴抗人球蛋白试剂，血清学专用离心机1 000 r/min，离心15 s，在显微镜下观察结果，有凝集为阳性，无凝集为阴性。也可以采用卡式抗人球法检测。参见《手工抗人球蛋白试验标准操作规程》。

8.2.1.2.2 游离IgG抗体测定（表11-8）　取试管3支，分别标记Ac、Bc、Oc，每管中各加2滴新生儿血清及相应A、B、O型试剂红细胞各1滴，置37℃水浴30 min取出，用生理盐水洗涤3次，最后一次控干上清，然后在各管中加1滴抗人球蛋白试剂，血清学专用离心机1 000 r/min，离心15 s，判读结果。也可采用凝聚胺法或卡式抗人球法检测。再取3系抗体筛查细胞检测新生儿血清中是否存在ABO系统以外的不规则抗体，可以使用卡式抗人球法检测。

表11-8　游离IgG抗体测定

8.2.1.2.3 放散试验（表11-9）　用生理盐水将新生儿红细胞充分洗涤4到6次，取1体积洗涤后压积红细胞加等体积的生理盐水，置56℃水浴10 min，其间不断振摇，然后在预温的离心管中以1 760 r/min，离心1 min，立即将上层红色放散液转移到另一试管中。取上清放散液分成三份，于标有A、B、O的试管中，分别加入相应的A、B、O试剂红细胞各1滴，置37℃水浴30 min，用生理盐水洗涤3次，最后一次控干上清，然后在各管中加1滴抗人球蛋白试剂，血清学专用离心机1 000 r/min，离心15 s，判读结果。也可采用凝聚胺法或卡式抗人球法检测。

表11-9　放散试验

8.2.1.3 产妇标本的检查

8.2.1.3.1 破坏产妇血清（或血浆）作交叉试验

用DTT或2-Me破坏产妇血清（或血浆）中IgM抗体，以此处理后血清分别与新生儿红细胞、与新生儿同型的实验室标准试剂红细胞做凝聚胺法或IAT的母子交叉试验。

8.2.1.3.2 产妇血清中ABO系统以外的抗体筛选

用处理后产妇血清作不规则抗体筛查，可采用凝聚胺法或卡式抗人球法检测。

8.2.1.3.3 测定产妇血清中IgG抗A（B）效价

母亲是O型，新生儿是A型时，测IgG抗A的效价，新生儿是B型时，测IgG抗B的效价。方法参照《ABO及Rh血型抗体效价测定试验标准操作规程》。

8.2.2 Rh新生儿溶血病血清学检查

8.2.2.1 母子标本的血型鉴定　分别取产妇、新生儿的洗涤红细胞鉴定Rh血型,具体操作参照《Rh血型分型试验（试管法）标准操作规程》。

8.2.2.2 新生儿标本的三项试验

8.2.2.2.1 直接抗人球蛋白试验　将子细胞用生理盐水充分洗涤3遍，最后一遍将上清控干，然后加1滴抗人球蛋白试剂，血清学专用离心机1 000 r/min离心15 s，判读结果，有凝集为阳性，无凝集为阴性。参见《手工抗人球蛋白试验标准操作规程》。

8.2.2.2.2 游离IgG抗体测定　取试管3只，标记1、2、3号，每管中各加2滴子血清，并分别加入1滴3细胞筛选细胞悬液，离心看结果，看好结果后，置37℃水浴30 min取出，用生理盐水洗涤3次，最后一次控干上清，然后在各管中加1滴抗人球蛋白试剂，血清学专用离心机1 000 r/min离心15 s，判读结果。也可采用凝聚胺法或卡式抗人球法检测。如果结果为阳性，应鉴定其抗体特异性，用10系细胞或10系细胞以上谱细胞做IAT法或凝聚胺法检测，结合谱细胞反应格局，确定抗体特异性。

8.2.2.2.3 放散试验（乙醚或氯仿放散法）

参照《吸收-放散试验标准操作规程》。

8.2.2.3 产妇标本的检查

8.2.2.3.1 测定产妇血清与新生儿细胞的交叉反应

用新生儿红细胞与2-Me处理后产妇血清（或血浆）做凝聚胺法或IAT交叉配血试验，以确定母亲血清中是否存在针对子细胞抗原的IgG抗体。

8.2.2.3.2 产妇血清中ABO系统以外抗体的检测

用产妇血清（或血浆）作不规则抗体筛查，可采用凝聚胺法或卡式抗人球法检测。如果存在ABO系统以外的同种抗体，则测定此抗体的特异性及效价,具体操作参照《不规则抗体筛查试验标准操作规程》和《ABO及Rh血型抗体效价测定试验标准操作规程》。

8.3 检验结果的输入与确认

8.3.1 启动“检验程序”，输入用户名及口令后，进入检验程序。

8.3.2 结果的输入　单击“检验”菜单，选择“检验结果录入\修改”，通过申请序号进行检验结果的录入及修改。

8.3.3 检验结果的确认　检验结果应由实验室负责人或授权人员进行确认，方法为单击“结果处理”菜单，选择“报告确认”进入结果确认，通过选择“工作单元”、“报告日期”、“单张”或“批量”后，按“提取”键提取已经传输或录入的检验结果，按“确认”键进行确认。

9．质量控制

9.1 室内质量控制

9.1.1 ABO血型、Rh血型鉴定　参照《ABO及RhD血型鉴定试验标准操作规程》；

9.1.2 抗体效价测定　参照《ABO及Rh血型抗体效价测定试验标准操作规程》。

9.1.3 不规则抗体筛查及鉴定　参照《不规则抗体筛查试验标准操作规程》。

9.1.4 产妇与新生儿之间检查配合试验　参照《交叉配血标准操作规程》。

9.2 室间质量评价　新生儿溶血病血型血清学检查目前尚无统一的室间质量评价活动。

10．干扰因素

已经发生新生儿溶血病的患儿血清一般呈红色可能会干扰对结果的判断。

11．结果计算及测量不确定度

不适用。

12．生物参考区间

不适用。

13．检验结果可报告区间

不适用。

14．警告/危急值

14.1 ABO血型不合时孕妇产前ABO抗体效价一般以64作为临界值，效价≥64认为可能有临床意义，需要进行动态观察抗体效价的变化，如果两次检测效价增加2倍或更多，被认为是发生新生儿溶血病的指征，应该进行更紧密的检测，以便及时采取治疗措施。

14.2 RhD血型不合时孕妇产前ABO抗体效价一般以16作为临界值，效价≥16认为有临床意义，需要进行动态观察抗体效价的变化。

14.3 新生儿标本的三项试验出现阳性结果时，提示新生儿溶血的存在。

15．实验室解释

孕妇体内血型抗体效价的升高提示发生新生儿溶血病的概率增大，需要进行连续动态监测。新生儿标本的三项试验出现阳性结果，提示新生儿溶血的存在，应根据严重程度进行相应的处理。

16．安全性预警措施

16.1 实验室及工作人员一般安全防护措施参见《实验室安全与卫生管理程序》。

16.2 发生血液标本溢出时，应参照《实验室消毒与清洁程序》对污染的环境进行消毒处理。

16.3 操作人员发生职业暴露时，应参照《实验室职业暴露预防与处理程序》及时进行相应处理。

16.4 在仪器运转过程中，勿触及样品针、移动的传输装置等，避免造成人身伤害。禁止触摸仪器密封面板内的电路，防止造成电击损伤。

16.5 对突发传染性疾病的血液标本应启动特殊的安全防护程序。

17．变异潜在来源

不适用。

18．新生儿溶血病血型血清学检查特别注意事项

18.1 ABO血型不合的新生儿溶血病一般用热放散法，Rh系统及其他系统的新生儿溶血病用乙醚放散法，放散液用抗人球蛋白法或其他检测IgG抗体的方法检测。

18.2 新生儿三项试验的结果之间有一定关联，有游离抗体的，直抗应该阳性，放散试验也应该阳性；直抗阳性的，放散试验也应该是阳性，但不一定有游离抗体。直抗阴性的其他两项试验应该是阴性，但ABO系统除外。一般说任何一项出现阳性都可以支持新生儿溶血病的诊断。也有实验结果与临床症状不完全符合的情况。

18.3 有报道提出有的母亲在胎儿娩出24 h以后，IgG抗A或抗B的效价可有明显的下降。

19．报告时间

新生儿溶血病血型血清学检查相对复杂，需要多重试验组合来得出最后结论,检测相对耗时，一般检测结果出来后立即上传HIS系统。

20．参考文献

[1] 相应试剂使用说明书．

[2] 临床输血技术规范．中华人民共和国卫生部医政司．北京，2000．

[3] 中国输血技术操作规程（血站部分）．中华人民共和国卫生部医政司．天津，

1997．