血清乙肝病毒荧光定量测定

1．检验目的

对人体血清中HBV-DNA进行定量检测，不仅可作为临床医生提供判断HBV感染者病毒复制水平的依据，并且可作为抗病毒治疗疗效的监测指标。

2．检测原理

HBV-DNA定量检测主要采用TaqMan实时荧光定量PCR的原理进行检测。

以TaqMan荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术，利用Taq酶的5′核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针的特性，通过荧光标记寡核苷酸探针进行测量。

3．设备性能参数

各种实时荧光定量PCR仪性能指标参见PCR仪说明书。

4．标本

血液标本见分子生物室标本采集、运送及验收标准操作程序。

5．设备和试剂

5.1 设备：BIO-RAD iCycler荧光定量PCR检测仪。

5.2 试剂

匹基HBV核酸定量检测试剂盒。

6．容器及试剂添加剂

血液标本采集的容器是不含任何抗凝剂的真空采血管；乳汁标本亦可采集至无菌杯内或不含任何添加剂的采血管内。

7．校准步骤

分别参见BIO-RAD iCycler荧光定量PCR检测仪的操作维护及校准程序。

8．操作步骤

8.1 检验申请单及标本的检查、标识编号　整理HBV-DNA定量检验申请单及血液等标本，审核合格后，对检验申请单和血液标本进行编号。

编号原则：HBV-DNA检验申请单编号每天均使用当日的年月日进行顺序的唯一编号，如2008年8月12日的HBV-DNA应编为20080812B××。编号完毕再对全部检验申请单、标本编号进行复查，确认无误后进行后续处理。

8.2 检验申请单的录入及申请工作单号

8.2.1 有申请序号的申请单录入　打开检验管理系统-检验管理-检验-申请单处理；在申请序号栏中扫入/录入申请单上的申请序号（如0814017160）点击回车键确认，然后将申请单上进行唯一编号（如20080812B××）。同时输入当前患者的样品“采集时间”和“接收时间”，检查申请单上病人信息及所申请项目与电脑自动调出的信息是否一致，检查完后点击“保存”或“F2”保存信息。

8.2.2 无申请序号的申请单录入　打开检验管理系统-检验管理-检验-申请单录入；在工作单号栏输入申请单上的唯一编号，产生当日“工作单号”；然后依次录入病人信息，如有病人ID号的可直接输入ID号调取病人信息，无ID号的则手工录入病人姓名、性别、年龄、费别等，同时输入当前患者的样品“采集时间”和“接收时间”，在申请项目名称栏中录入该病人所申请的项目，然后点击“保存”按钮。

8.3 检验步骤

8.3.1 样本处理（样本处理区）　戴一次性手套，取待测血清、阴性质控、弱阳性质控、强质控品各100μl，在生物安全柜中分别加到已编号的1.5 ml离心管中（同时分装血清至标有唯一编号的离心管中，每管分装300～400μl）；再加入100μl DNA提取液1（换手套），充分振荡混匀，13 000 r/min离心10 min，吸弃上清液；换手套再加入25μl DNA提取液2，振荡至沉淀完全溶解。2 000 r/min离心10 s，100℃干浴10 min，13 000 r/min离心10 min并4℃保留上清液备用。

8.3.2 试剂配制（试剂配制区）　在超净台中提前从试剂盒中取出HBV PCR反应液室温融化后，配制时再取出Taq酶及UNG，2 000 r/min离心10 s。设所需要的管数n（n=样本数+1管阴性质控+1管弱阳性质控+1管强阳性质控+4管阳性工作标准品），按每管PCR反应液37.6μl，Taq酶0.4μl，UNG 0.06μl。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反应管中分别加入38μl，转移至样本处理区。

8.3.3 加样（样本处理区）　在所设定的n个反应管中分别加入处理过的样本（于生物安全柜中），阴性对照、质控品、强阳性对照、临界阳性对照上清液以及阳性参控品各2μl（于工作台面上），盖紧PCR反应管管盖，转移至检测区，置于PCR仪上。

8.3.4 PCR扩增（扩增区）

循环程序设置为：

37℃：5 min，94℃：1 min，95℃：5 s，60℃：30 s，42 Cycles。

反应体系为40μl。

荧光信号收集时设定为Fam荧光素，荧光信号收集设在60℃。

8.3.5 结果分析

8.3.5.1 基线（baseline）确定：取为2～10或2～15个循环的荧光信号。

8.3.5.2 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪声线）的最高点，且CT值=0.0为准。也可根据仪器噪声情况在15.0～40.0之间调整。

8.3.5.3 为避免漏检强阳性样本，应首先将基线定为6-10/3-10/2-10个循环的荧光信号观察分析CT值，如果没有CT值<16.0的样本，则将基线定为6-15/3-15/2-15个循环的荧光信号进行结果分析；如有CT值<16.0的样本，则应将该样本剔除此次结果分析（作复查或10倍梯度稀释，重新测定），同时仍将基线定为6-15/3-15/2-15个循环的荧光信号进行结果分析。

8.3.5.4 点击standard curve，得到样本拷贝数。

8.3.6 结果判断　本检测系统灵敏度为：5.0×102 U/ml。定量检测线性范围为：1.0×103～5.0×107copies/ml。

阳性工作标准品的CT值都应小于38.0。将阳性工作标准品1-4的拷贝浓度输入，仪器将自动以阳性工作标准品拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的CT值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度（r）的绝对值应大于等于0.980，否则视为定量结果无效。

阴性对照的CT值都等于0；强阳性对照的CT值应小于等于30.0，HBV DNA拷贝数应1×105～1×107 U/ml；临界阳性对照的CT值应大于强阳性对照的CT值，并小于等于38.0，HBV DNA拷贝数应为1×105～9×104 U/ml；否则实验视为无效。

检测样品中5.0×102 U/ml≤HBV DNA≤5.0×107 U/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数。

检测样品中HBV DNA>5.0×107 U/ml,可直接报告为>5.0×107 U/ml，也可用正常人血清按10倍梯度做相应稀释，使其拷贝数落在1×105～5.0×107 U/ml范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。

检测样本HBV DNA<1×102 U/ml，拷贝数仅供参考，报告为低于最低检测下限。

CT值=40.0或0.0时，结果为阴性，报告为低于最低检测下限。

8.4 检验结果的输入

8.4.1 结果分析完毕，打印出原始PDF文档结果；再打开连接LIS电脑，启动“检验程序”，输入用户名及口令后，进入检验程序。

8.4.2 手工结果的输入　单击“检验”菜单，选择“检验结果录入\修改”，进行检验结果的录入及修改。根据流程表结果记录中唯一编号下的结果一一对应录入至检验系统；同时输入当前患者的样品“采集时间”和“接收时间”，并逐个检查患者以前检测结果，进行历史回顾，观察变化趋势。

8.5 检验结果的确认　检验结果的确认应由主管技师（主治医师）或专业实验室负责人进行确认，方法为单击“结果处理”菜单，选择“报告确认”进入结果确认，通过选择“工作单号”、“报告日期”、通过“单张”或“批量”后，按“提取”键提取检测结果，逐一按检验项目和原始结果记录进行核对，按“确认”键进行确认。

9．质量控制措施

9.1 室内质控措施

9.1.1 血清质量控制品

9.1.1.1质控品的来源　卫生部临检中心购买HBV中值血清（定量105 U/ml）；试剂盒提供各浓度梯度血清；自制阳性血清。

9.1.1.2室内质控品的制备　收集本室检测的临床样本，HBV DNA定量为103、107 U/ml的样本分别混匀，并分装于0.5 ml的离心管中，每支110 μl，编号后（如Qb0801+于-20℃保存）。

9.1.1.3 室内质控操作　每天质控品与样本同时处理，排列顺序为：临床标本，阴性质控品，弱阳性或强阳性对照（视当月质控品浓度而定，中、高值质控品带弱阳性对照；低值为强阳性对照）阳性质控品（3个月覆盖3个水平按103或104、105、 106或107水平依次带入质控），标准品或校准品。记录每日质控结果，计算前20次检测结果的平均值（X）作为本批质控品的靶值，并计算s和CV进行室内质控图的绘制。对于失控情况按照《分子生物室质控处理规程》的相关规定步骤进行处理，并做好相应的详细记录。

9.2 室间质控措施　每年参加卫生部临床检验中心及WHO室间质控。

10．干扰因素

10.1 内源性的PCR抑制物　天然存在于标本中的标本组成成分如：免疫球蛋白、血红蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、脂类、尿素、离子、多糖等。因此严重溶血、脂血标本影响HBV-DNA的检测。

10.2 外源性的PCR抑制物：如肝素抗凝剂、纤维素、硝酸纤维素、滑石粉、矿物油等。

11．结果计算

血清HBV-DNA通过对已知浓度梯度的阳性标准品的检测，仪器根据标准曲线及设定的基线对未知标本自动计算出其浓度。每次实验计算结果的可信度由标准曲线的拟和度（r）、斜率以及截距所决定，详细参见8.3.5结果分析内容。

12．生物参考区间

HBV-DNA定量检测的生物参考区间为低于检测下限，本实验室的检测下限为5.00E+0.2 U/ml。

13．患者检验结果可报告区间

BIO-RAD CFX-96检测深圳匹基公司HBV-DNA荧光定量试剂盒的患者检验结果可报告区间为5.00 E+0.2～5.00 E+0.8 U/ml。

14．警告/危急值

HBV-DNA定量检测结果无警告/危急值。

15．实验室解释

15.1 治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择对症药品，避免盲目用药。

15.2 治疗后定量测定可直接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的判断。

15.3 怀孕前进行定量测定，有助于选择有利的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量检查，有助于使部分患者得到及时、正确地诊断。

15.4 一般认为，HBV DNA>109拷贝/ml，日常生活密切接触强传染性；HBV DNA>105～106拷贝/ml，日常生活密切接触传染性较小；HBV DNA<105拷贝/ ml，日常生活密切接触几乎没有什么传染危险性。

值得注意的是，不管HBV DNA的浓度为多少，哪怕是低于相应定量方法的测定下限，也均会引起输血后的感染。

16．安全性预警措施

16.1 实验室及工作人员一般安全防护措施见《安全手册》。

16.2 血液标本溢出后，由工作人员立即用1 000 mg/ml 有效氯制剂或75%酒精溶液对污染的环境进行消毒。

16.3 如果操作人员的皮肤或衣物上沾到了血液及废液，应立即用0.2%过氧乙酸溶液或75%酒精溶液消毒处理，再用肥皂水、清水进行冲洗。如果眼睛中溅入血液及废液，使用眼部冲淋装置用大量的清水冲洗并采取必要的医疗措施。

16.4 如血液标本采用开盖程序测试均应在生物安全柜内进行，开盖时应防止气雾胶污染环境。

16.5 与血液标本接触的一切器皿、仪器组装/拆卸组合零件都应视为污染源，因此操作人员应采取必要的保护性措施如穿戴保护性外套、手套等。不小心接触了这种污染源时，应立即用清水冲洗被污染区域并用0.2%过氧乙酸溶液或75%酒精溶液进行消毒处理。

16.6 对突发传染性疾病的血液标本的防护应启动特殊的安全防护程序。

17．变异潜在来源

严重的黄疸或脂血液标本可使乙肝病毒（HBV）荧光定量检测结果假性偏低；

标本溶血可使乙肝病毒（HBV）荧光定量检测结果假性减低；

试剂经过反复冻融后，荧光值可能下降影响结果判读；

检测器微孔不完全堵塞；

标本采集后放置的环境温度过高、时间过长，未达到标本采集要求。

18．报告时间

HBV-DNA定量检测的检测周期为一天，每天10点半以前接收（住院或门诊患者）标本当天下午4点出具报告结果，之后接收标本次日下午4点出具结果；住院患者结果由检验科后勤组工作人员发送报告单至临床科室，门诊患者于门诊部二楼检验科化验单领取处领取结果。需要复检标本应出具报告延迟通知，于次日4点出具检测结果。

19．参考文献

[1] 《匹基生物HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒用户操作指导》．

[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程．3版．南京：东南大学

出版社，2006．

[3]李金明．实时荧光PCR技术．北京：人民军医出版社，2007．