细胞学标本的染色方法

细胞学的常规染色方法可采用巴氏法、HE法等染色法，笔者推荐巴氏法。

（一）巴氏染色法（Papanicolaou’s，Pap）

支气管及肺细胞学标本可以采用巴氏染色法。

【染液配制】

1．Harris苏木精配制方法（1000ml）

苏木精5g

95%乙醇（AR）50ml

亚明矾（硫酸铝氨）100g

蒸馏水加至1000ml

黄色氧化汞2．5g

先将苏木精溶解于95%乙醇中，同时将亚明矾（媒染剂）溶于蒸馏水中，徐徐加热至沸使之完全溶解。然后将苏木素溶液缓缓加入，加热至沸，立即挪开火焰。再将氧化汞粉末加入，同时搅拌，当溶液变为深紫色时，表明苏木精已经氧化成苏木紫，即应迅速将盛液体的器皿置于冷水中冷却，以免苏木紫过度氧化而出现棕色沉淀。

配制完毕，将溶液置入棕色小口瓶中，瓶口塞棉花或纱布，暂不封闭，以便溶液内剩余的苏木精慢慢氧化。

2．橘黄G6液　取橘黄G63g溶解于30ml蒸馏水中，完全溶解后加入无水乙醇（AR级）至600ml，过滤后使用。

3．EA36溶液配制　为三种染料配合而成。

先配制原液（常备液）：原液至少提前7d配制，用前按比例混合。

亮绿（light green）：2．5g（原方法为0．5g，经多次配制并实际应用效果不理想，故改为2．5g染色反应佳），溶在25ml蒸馏水中，可温水浴使之完全溶解，然后将无水乙醇（AR）加至500ml。

醇溶伊红（eosin）：2．5g溶于25ml蒸馏水，然后加无水乙醇（AR）至500ml。

俾士麦棕（bismark brown）：0．5g溶于5ml蒸馏水中，然后加无水乙醇（AR）至100ml。

配合方法：（600ml EA36液）

磷钨酸0．6g溶于少许蒸馏水中加入到混合液中。

【附】

1．盐酸-乙醇的配制　70%乙醇600ml加入6滴浓盐酸。

2．稀碳酸锂的配制　600ml蒸馏水加碳酸锂饱和液6滴。

3．二甲苯-纯乙醇的配制　二甲苯和100%乙醇各300ml。

【染色步骤】

（1）将固定后的涂片置入水中（蒸馏水或纯净水）1min。

（2）Harris苏木素液1～3min（视染液浓度与配制时间而定）。

（3）水（蒸馏水或自来水）漂洗2～3次（甩尽）。

（4）盐酸-乙醇浸1～3次（见有红色刚出现立即水洗）。

（5）自来水，浸洗1～2次。

（6）稀碳酸锂，涂片返蓝为止（时间可稍长，1min）。

（7）依次置入95%Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ乙醇，各10s（脱水）。

（8）橘黄G6液，2～5s（染胞质）。

（9）95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5s（快速漂洗）。

（10）EA36液，20～40s（视染液浓度而定）。

（11）95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10s（精漂洗）。

（12）无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1min（彻底脱水）。

（13）二甲苯-乙醇1min（缓冲）。

（14）二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2～3min（透明）。

（15）树胶盖片封固。

【染色结果】　巴氏染色法具有迄今为止其他染色方法无法相比的优点：细胞核细微结构清晰，能辨认染色质的模式；细胞质透明多彩，质感细腻；显示细胞分化和角化程度；在液基片中易突出或发现问题细胞。因此，巴氏染色法是细胞学中最经典、最重要的染色方法。

【注意事项】　为了使染出的涂片效果较佳，需要在如下几个方面加以注意。

（1）在配制巴氏染色和进行巴氏染色时，必须注意所购置的染色剂是否符合原配方所要求的试剂，特别是EA36所必需的染色剂，如亮绿、醇溶性伊红等。经常有购置其他试剂来替代染色剂配方要求试剂的作法，这样做的结果可想而知。特别是采用水溶性伊红替代醇溶性伊红，或将甲基绿（methyl Green zinc chloride salt，分子式C27H35BrClN3．xZnCl2）、灿烂绿（brillant blue，别名煌绿，乙基绿，分子式C27H34N2O4S）当作亮绿（light green SF yellowish，high purity biological stain，pure；别名淡绿、光绿、黄绿等，分子式C37H34N2Na2O9S3）来配制亮绿常备液更是不可取的作法。

（2）精确掌握苏木精的染色时间，染色过深与过淡均不合要求，一般要求核为蓝色或蓝紫色。

（3）盐酸-乙醇分化后要用水洗干净。

（4）过稀碳酸锂除去多余的酸性液体并巩固细胞核的碱性。稀碳酸锂对巩固细胞核的碱性效果较好，利于长期保存不褪色。

（5）乙醇定期更换，以保证浓度与脱水效果。如果胞质中出现灰色或分色效果不好，说明脱水效果差，应更换乙醇。

（6）染色液的更换，一般认为当500ml染液染1500～2000张片子时，应更换染液。另外当每次染色的片量少，总量虽不足2000张片，但染液配制的时间超过4个月，应当更换染液。

（7）染色时间的掌握要根据染液配制时间的长短、染片数量的多少、固定时间的合适度等，并且还要根据阅片者的习惯以及所染细胞的种类等有所不同，需要进行微小的调整。

（二）抗酸杆菌染色法

适用于痰液涂片及淋巴结穿刺疑为结核者。

【染液配制】

（1）苯酚复红溶液

【染色方法】

（1）涂片。

（2）滴加苯酚复红溶液，在火焰上加热3min，以染液发生蒸气为度，不可干涸。

（3）放置5min冷却，水洗。

（4）滴加3%盐酸乙醇2～3min，使红色褪尽，水洗。

（5）滴加10%硫酸，立即水冲洗干净，不残留硫酸（可省去）。

（6）滴加蒸馏水后，再滴加亚甲蓝溶液，染色0．5min左右，水洗，干后在油镜下观察。

【染色结果】

（1）结核杆菌呈红色，杆状。

（2）各种细胞均染成蓝色。

【附1】　痰涂片抗酸染色的判读标准（上海胸科医院、上海结核病防治所。1975年）

至少观察100个油镜（下同）视野，未发现抗酸杆菌者继续观察300个视野，每300个视野0条为（-），每300个视野1～8条时直接报告所查抗酸杆菌条数，每100个视野3～9条为（＋），每10个视野1～9条为（），每个视野1～9条为（），每个视野≥10条为（）。

【附2】　抗酸染色方法的实践

将痰液或刷取、针吸等标本，直接在载玻片正面右侧2/3处均匀涂抹成10mm× 20mm的圆形厚片。自然干燥后进行染色。痰液或支气管灌洗液等，如果标本量充足，也可采用液基集菌制片技术，提高集菌率。

制备好标本玻片后，将玻片放到电磁炉顶的钢板上，电磁炉接通电源，70℃加热3min，最长不要超过5min。加热完毕后把玻片放到染色架上，马上滴加苯酚复红染液盖满痰膜染色3min。用流水轻缓冲洗玻片加盐酸乙醇脱色1min，用流水洗去脱色液后再滴加亚甲蓝复染30s后用流水洗掉染液。沥干镜检。

以上操作方法仅供参考。

（三）高碘酸Schiff反应（PAS）显示糖原法

（1）1%过碘酸液2～5min。

（2）蒸馏水洗数次。

（3）Schiff试剂处理8～10min。

Schiff试剂配制：煮沸蒸馏水200ml，停火后加入碱性品红1g，不停搅拌使溶解。待溶液冷至50℃加入1N的HCl20ml，冷至室温（25℃）加入偏重亚硫酸钾（或钠）1g摇荡，置暗处过液，又加药用碳2g（不要用过期的）充分摇荡数分钟，过滤，滤液应呈无色或深黄色，盛入有色瓶内，于冰箱（4℃）保存。

（4）流水冲洗5～10min。

（5）用普通苏木精染核，再水洗（核染色应淡，时间要短）。

（6）脱水，透明，封片。

结果：糖原及其他PAS阳性物质均呈品红色（经淀粉酶消化后糖原无色，核蓝色）。

其他染色根据需要可选择使用，参考组织病理学组织化学或细胞化学方法。

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