肿瘤内血管生成

（一）肿瘤血管生成学说

早在20世纪初，Goldman就观察到血管围绕肿瘤生成（angiogenesis）现象。1968年Greenblatt和Shubik提出了肿瘤可产生弥漫性血管生成物质的假设。1971年Folkman依据前人研究及自身工作，提出了肿瘤生长和转移依赖血管生成，阻断血管生成是遏制肿瘤生长的有效策略这一学说，主要包括以下内容。

1.大部分实体瘤可长期处于无血管生成的休眠（dormant）状态，在无血管状态下，肿瘤依靠简单被动扩散获得营养，最大生长直径＜2mm。

2.在一定状态下，周围血管通过芽生（sprouting）方式生成新血管并进入肿瘤组织。

3.肿瘤细胞产生的肿瘤血管生长因子（tumor angiogenesis factor，TAF）能触发肿瘤血管生成。

4.通过抑制TAF产生或直接针对新生血管的内皮细胞等策略阻断血管生成，有可能抑制肿瘤生长。

5.抗血管生成只能使肿瘤停止生长或缩小至直径为1～2mm的无血管状态，而并非能彻底根除全部肿瘤细胞。1976年Gullion的工作显示，癌前组织细胞在演变成癌细胞过程中获得了血管生成能力，但该领域研究直到Folkman在1987年从肿瘤细胞中分离获得第一个TAF，即碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bF-GF）后才引起学术界广泛兴趣。尤其近10多年来，人们对肿瘤血管生成机制进行了深入研究，数十种内源性血管生成激活因子（pro-angiogenic mole-cules）和血管生成抑制因子（anti-angiogenic mole-cules）已被分离与鉴定，两者平衡状态所决定的“血管生成开关”（angiogenic switch）系统已被广泛接受。

肿瘤的血管生成过程是肿瘤周围原有毛细血管内皮细胞在各种促血管生成因子的作用下一个复杂的级联过程，涉及许多生物活性物质及各种细胞间的相互作用，可依次划分为3个主要步骤。

（1）肿瘤血管生成的启动：肿瘤细胞的快速增殖导致肿瘤局部的缺血缺氧，这可能是肿瘤血管生成的最初重要的启动因子。缺血缺氧可直接刺激血管生成，并促进多种组织细胞产生多种促血管形成因子。

（2）血管内皮细胞的增殖及向肿瘤实体组织的迁移：当血管内皮细胞下基膜降解并形成新的血管芽胚后，芽胚周围的血管内皮细胞在各种生长因子的作用下迅速增殖并穿过芽胚向肿瘤组织定向迁移。

（3）新生血管的成熟：新增殖的血管内皮细胞再进一步与血管外的基质细胞相互作用，形成相对完整的血管结构。

虽然肿瘤血管生成是一个动态的连续过程，但从超微病理角度可分为6个相对独立的步骤：①肿瘤的各种成分释放多种血管生成因子；②血管内皮细胞（EC）在血管生成因子作用下出现形态学改变，包括各种细胞器数目和大小增加、伪足出现；③EC和肿瘤细胞释放蛋白溶酶以降解毛细血管基底膜和周围的细胞外基质，继而引起细胞外基质重塑；④EC从毛细血管后微静脉迁徙出来形成血管新芽；⑤EC增殖；⑥肿瘤微血管分化和成型。

肿瘤血管在细胞组成、组织结构及功能特点上与正常血管有明显差异，例如，肿瘤血管缺乏完整血管的周边细胞，使其对氧浓度或激素浓度改变的承受力降低；血管壁并非由单一的内皮细胞层构成，单纯肿瘤细胞或肿瘤细胞与内皮细胞之间均可形成血管壁内层细胞，形成马赛克样血管。与正常血管相比，肿瘤血管表现为高度无序、纡曲、膨胀、粗细不匀，分支过多等。这种分布状态可导致血流紊乱、缺氧及酸性物质堆积区形成。肿瘤血管超微结构同正常血管也有差别，其管壁细胞间隙增宽，有很多开口，缺乏管内支持结构，且基底膜断裂或缺失。此外，肿瘤血管内皮细胞表现为形态异常、重叠生长、突入管腔等，这些改变导致肿瘤血管泄漏增加。肿瘤内缺乏正常的淋巴管结构，外渗液体的回流受阻，使组织间隙压力过高。研究表明，抑制正常组织血管生成的调控机制并不能控制肿瘤血管生成。肿瘤新生血管缺乏神经支配和对血管活性物质反应的结构基础，在形成后不再进一步分化为相应的动、静脉，也无平滑肌成分，不具有收缩功能。与静止的血管内皮细胞相比，肿瘤血管的内皮细胞增生活跃，细胞表面的生长因子（VEGF）受体KDRFlt-1和整合素αvβ3等分子表达上调。Croix等人用基因表达系列分析方法证实了肿瘤血管内皮细胞与非肿瘤血管内皮细胞的基因表达存在着区别，并发现了79个基因有表达差异，其中46个在肿瘤血管内皮细胞中表达增加，而在其他血管内皮细胞，包括胚胎血管内皮均不表达或表达甚低。

（二）肿瘤新生血管形成机制及与肿瘤浸润、转移关系

原发和转移性肿瘤在生长、扩散过程中都依赖血管生成。有证据表明，肿瘤生长和扩散转移与血管生成密切相关。

1.在肿瘤直径＜2mm时，肿瘤生长缓慢，原发肿瘤仅局部浸润，尚不发生转移，成为所谓“潜伏期”。只有当肿瘤继续生长＞2mm时，微血管逐渐形成，肿瘤实体随之迅速增大，进而发生扩散与转移。

2.肿瘤实体内微血管数量与肿瘤转移潜能成正相关。对黑色素瘤及乳腺癌观察中发现，肿瘤实体内微血管数目增多提示预后欠佳。

3.某些血管生成素与生长因子如VEGF、EGF、FGF通过促进血管生长大大增加了肿瘤转移概率。

4.某些血管生成抑制药能抑制肿瘤在体内生长与转移，但在体外培养时不能抑制肿瘤细胞生长。

5.研究还证实，随着肿瘤血管生成数目不同，肿瘤转移及复发概率也有明显差异。Brem等首先提出肿瘤内血管数量可能与肿瘤分级和侵袭性相关。Bosari等对187例乳腺癌患者进行了长达9年的随访研究发现，微血管密度与乳腺癌预后密不可分，而且为一独立预后因素。此后，国内外许多学者通过对各种系统肿瘤研究发现，瘤组织的微血管密度几乎是所有证实体瘤独立的预后因素。基于以上事实，研究血管生成抑制剂以达到阻断肿瘤转移已成为抗肿瘤研究的热点。

（三）肿瘤血管生成调控机制

生理性血管生成是一个受各种内源性的血管生成激活因子和抑制因子精密调控的过程，一般生理状态下成体内皮祖细胞是处于休眠状态，只有在创伤愈合、组织修复和卵巢黄体形成等过程中才出现新血管的生成。肿瘤血管生成与生理条件下的血管生成相比有很大的差异，主要表现为其无控性和未成熟性。目前发现肿瘤血管形成主要有以下5种方式：①出芽方式（sprouting angiogenesis），即以出芽的方式从原有的血管上分生出新的血管；②在干细胞分化为内皮祖细胞的参与下由内皮细胞一步一步形成新的血管；③内填作用（intussusception），从已有的“母血管”上分支出小血管即由一些细胞基质组织的渗入；④笼状血管（cooption），从如脑和肺部可以看到肿瘤血管与正常的血管很相似，但其周围由很多肿瘤细胞包围；⑤伪造血管。

与肿瘤血管生成相关的因子有很多。一系列血管生成因子（angiogenic factors）、细胞因子（cytokine）、细胞外基质和黏附分子等均参与了血管生成过程。血管生成因子主要包括血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族、成纤维细胞生长因子（FGF）家族、血管生成素（Ang）家族以及表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等，其中VEGF家族是已知的特异性作用于内皮细胞的生长因子，在血管生成过程中起的作用也最为重要。抗血管生成策略已成为肿瘤治疗的重点和热点，至2007年底已有贝伐珠单抗（bevacizumab，Avastin），培加尼布（pegaptanib，Macu-gen），雷珠单抗（ranibizumab，Lucentis），索拉非尼（sorafenib，Nexavar）和舒尼替尼（sunitinib，Sutent）共5个作用于VEGF或血管内皮生长因子受体（VEGFR）的药物上市，还有大量的此类药物处于临床研究。

1.VEGF家族的特性　虽然最近有许多新的发现，但是VEGF家族在肿瘤血管生成中所起到的重要作用是不容置疑的，VEGF家族在血管的发生（angiogensis）、淋巴管的形成（lymphogenesis）和血管的生成（vasculogenesis）过程中都具有重要的作用，目前的研究表明，VEGF家族主要包括5个成员，即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF，这些VEGF家族成员都是分泌型糖蛋白，以同源二聚体的形式存在。而其受体主要有5个，包括3个有酪氨酸激酶活性的受体（VEGFR1/Flt-1、VEGFR2/Flk-1/KDR、VEGFR3/Flt-4）和2个没有酶活性受体（neuropili-1和neuropilin-2）。

在VEGF-A、VEGF-B、PIGF中，其mRNA前体不同的剪切方式形成多种异构体。VEGF-A由8个外显子和7个内含子组成，不同的剪切方式形成5种单体，即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206，其中VEGF165是VEGF-A最重要的同源单体，缺少由外显子6编码的残基，有肝素结合位点，既可以分泌到细胞外也可以结合到细胞表面或细胞外基质，同时含量也最多，分裂源性最强。VEGF-B含有2种异构体即VEGF167和VEGF186。VEGF186是分泌型的，而VEGF167含量多，与硫酸类肝素多糖蛋白结合，在体内不可以自由扩散。VEGF-B的具体功能还不清楚。VEGFC由7个外显子构成。VEGF-C前体蛋白含有1个端信号肽、VEGF-A同源区和1个C端前肽。VEGFC前体蛋白与VEGFR3结合，成熟蛋白既可以与VEGFR2又可与VEGFR3结合，VEGF-C在胚胎的发育过程中有促进淋巴管形成作用，在成体中有维护淋巴管的作用。VEGF-D与VEGF-C结构相似，人VEGF-D由7个外显子和6个内含子组成，在结肠癌、肺癌、卵巢癌中VEGF-D的表达与淋巴结的转移有关。VEGF-E是从羊口疮病毒感染组分离出来的，具有刺激内皮细胞的增殖、迁移、发芽作用，还具有增强血管的通透性的作用。

2.VEGFR的分类与功能　VEGFR家族主要包括VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（Flk-1/KDR）、VEGFR-3（Flt-4）3个成员，属于受体型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kina-ses，RTKs），由3部分组成，包括胞外的7个免疫球蛋白样结构域、跨膜区和胞内的酪氨酸激酶活性区。VEGFR-1是VEGF-A、VEGF-B和PlGF的高亲和性受体，存在于血管内皮细胞、造血干细胞、巨噬细胞和单核细胞表面，与这些细胞的迁移有关。VEGFR-2存在于血管内皮和淋巴管内皮细胞表面，在巨核细胞和造血干细胞中也有表达，是血管生成的主要因素。VEGFR-3与VEGF-C和VEGF-D结合，维持血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞的存活，并诱导它们的增殖和迁移。这些受体或相应配体的过量表达，会通过多条路径、多种机制激活细胞内信号转导，信号蛋白进入细胞核激活转录因子，导致细胞增殖失调、凋亡抑制、血管生成、细胞侵袭和转移等，进而导致肿瘤和其他相关疾病的发生。

图6-5-1　VEGFR酪氨酸激酶信号转导途径

3.VEGFR酪氨酸激酶信号转导途径与肿瘤血管生成　VEGF家族成员与细胞表面的相应受体结合，使其发生同源或异源二聚化和自身磷酸化而激活，而后与接头蛋白结合激活下游的一系列信号分子，引起肿瘤的发生和发展，见图6-5-1。接头蛋白可分为2类：一类是具有酶催化活性的，如Src激酶（SarcomaTK）、磷脂酶C-γ（PLC-γ）等；另一类仅起连接作用，如生长因子受体结合蛋白2（Grb2）等；还发现有的蛋白兼有上述2种作用，如磷脂酰肌醇-3激酶（pI3K）的p85亚基。

RAS/Raf/MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号转导途径是VEGF样配体激活的主要途径，调控细胞增殖和生存过程。受体磷酸化后与接头蛋白如Grb2结合，Grb2的SH3结构域（Src同源结构域3）与下游的G蛋白交换因子（如SOS）结合，SOS募集并激活RAS，依次再激活Raf（即MAPKKK）、MEK（即MAPKK）和MAPKs如ERK（细胞外信号调节激酶），JNK（JunN-terminal kinase），p38（即high os-molarity glycerol）等，MAPKs进入细胞核通过磷酸化激活转录因子（如Elk1，Ets，c-Myc等），从而干扰细胞周期和细胞转化过程，最终导致肿瘤形成；MAPKs还能诱导蛋白及基质降解、促进细胞迁移、维持肿瘤生长。

另一重要的pI3K/AKT（蛋白激酶B，PKB）途径涉及细胞生长、抑制凋亡、侵袭和转移过程。受体磷酸化后与pI3K的p85亚基结合激活pI3K，PI3K促使磷脂酰肌醇三磷酸酯（PIP3）生成，后者激活下游的AKT途径；受体酪氨酸激酶还可以通过RAS途径激活pI3K/AKT通路。AKT转移至细胞核，调控多种转录因子（如FKHRL1，NF-κB，Bcl-2等），抑制凋亡基因的表达；AKT还能磷酸化糖原合成激酶-3（GSK-3）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）从而上调周期蛋白D（Cyclin D），以及磷酸化一系列抑制蛋白（如p21CIP1和p27KIP1），引起细胞周期变短，从而导致肿瘤发生。细胞质中的Src非受体酪氨酸激酶也可以被VEGFR激活，Src再激活一系列蛋白底物，包括RAS，pI3K，信号转导和转录激活因子（STAT）等，调节细胞增殖、转移、黏附、免疫和血管生成。此外，VEGFR的信号转导还可经PLC-γ介导，激活肌醇三磷酸酯（IP3）和甘油二酯（DAG），后者激活蛋白激酶C（PKC），PKC激活Raf/MAPK和转录因子c-Jun等，PLC-γ途径在VEGFR-2信号转导中起着重要作用。

4.肿瘤血管生成抑制药　目前，在临床前实验及临床试验中，调控设计抗血管生成作用的靶点有如下。

（1）以促血管生成的相关因子为靶点。

（2）以促血管生成因子的受体为靶点。

（3）以细胞外基质为靶点。

（4）以肿瘤血管内皮细胞为靶点。

（5）以肿瘤内皮细胞表面所特有的蛋白或分子为靶点。通过设计研制相应的药品或制剂作用于以上某个或某些靶点，达到抑制或阻断肿瘤血管生成的目的，以实现抗肿瘤血管生成的靶向治疗。

目前，阻断VEGFR信号转导的方法包括使用VEGF单克隆抗体（如bevacizumab）或抗体片断（如ranibizumab）、VEGF类似物（如pegaptanib）、VEGFR酪氨酸激酶小分子抑制药等。抗体的制备方法和给药方式在一定程度上限制了其临床应用，VEGF抗体的种类和发展也没有小分子抑制药丰富，VEGFR酪氨酸激酶小分子抑制药的结构类型较多、差异也较大。SU5416是新合成的VEGF受体Flk-1/KDR酪氨酸激酶的抑制物，Ⅰ期临床试验提示，对肝癌和非小细胞肺癌及脑胶质瘤有较好的临床疗效，可用于防止肿瘤复发，其远期疗效期望通过Ⅲ期临床试验进行评估。SU6668可作用VEGF、bFGF和PDGF受体，从而阻断血管生成因子的合成和释放，并拮抗其作用，Ⅰ期临床试验提示，对非小细胞肺癌有较好疗效。

20世纪80年代开始研究基质金属蛋白酶抑制药（TIMP），这类抑制药可抑制金属蛋白酶活性，防止细胞外基质降解和基底膜破坏，以达到抑制肿瘤血管生成效应。目前已有天然MMP抑制药，如neovastat（Ⅲ期临床试验）；人工合成的MMP抑制药，如BAY12-9566 （Ⅲ期临床试验）、AG-3340（Ⅲ期临床试验）、CGS-27023A（Ⅱ期临床试验）、COL-3（Ⅱ期临床试验）、BB2516（Ⅱ期临床试验）、MS-275291（Ⅰ期临床试验）等。BB2516是新一代合成的TIMP，也是最早进入Ⅱ期临床试验的口服TIMP，主要用于卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌治疗。

细胞内信号转导远比上述过程复杂，各信号通路间频繁交叉、相互作用，所以肿瘤的治疗靶点很多，必要时还需从多个靶点联合治疗方能见效。在最近临床研究中发现bFGF可以独立于VEGF刺激肿瘤血管的生成，CXCL12/SDF1α在大鼠中也能独立于VEGF诱导肿瘤血管的生成。这些发现表明，要进一步研究anti-VEGF药物在抗肿瘤治疗过程中出现复发时，VEGF、bFGF、CXCL12与肿瘤血管生成之间的关系，而且一些新的分子，如Angiopoietin、NOTCH家族、神经导向分子与肿瘤血管生成有密切联系。Angiopoietin-1和Angiopoietin-2能够与内皮细胞上同源的酪氨酸激酶受体TEK和TIE2结合，调控内皮细胞生存和血管生成。由于NOTCH家族与VEGF在肿瘤血管生成过程中关系紧密，因此最近受到广泛的关注。同时研究发现了4种主要的神经导向配基（ephrins、semaphorin、slits和netrins），它们与其受体的结合在脉管的导向方面发挥着重要的作用，这些表明血管和神经的形成比预想的有更多相似的过程，从而为通过抗血管生成治疗肿瘤开辟了新的方向。