脂代谢相关基因多态性

高脂蛋白血症与动脉粥样硬化均有一定的家族性和遗传性，属于多基因病，是多微效基因协调作用并与环境因素共同作用的结果。因其发生涉及2个以上基因或表达调控的改变，在家系分析难以获得的情况下，目前多采用以同胞对或人群为基础的关联分析方法研究候选基因多态性与疾病的关系，其中确定研究样本的代表性是最重要的一步，并应对目标对象进行详细的流行病学调查，通过分子生物学、遗传统计学和生物信息学技术，最终确定出易患基因。

载脂蛋白、酶蛋白和脂蛋白受体等基因缺陷的种类并非是单一的，而是多位点多类型，多种基因突变。不同种族，不同人群、基因缺陷的位点、性质及其突变点都可能不一样。目前还不能总结出这些基因变化与动脉粥样硬化（As）形成的确切关系，还未找到引起As和高脂蛋白血症的关键基因及其关键基因缺陷、位置和性质。As有关基因多态性和基因变变分析方法在发病机制探讨和基因诊断方面，已有大量的文献报道。

（一）基因突变类型

家族性高脂血症均由单基因的缺陷所导致，按突变在基因结构中发生变异的部位，不外乎以下几类：

1．基因调控序列的变异 基因调控序列包括基因的启动子、操纵基因、增强子和衰减小的序列等，这些序列的完整性对结构基因表达与否与表达水平起着至关重要的作用。这些序列的变异会影响结构基因的表达。

2．外显子部分的变异 外显子是基因的编码部分，其突变会直接引起蛋白质结构的功能的改变。

3．内含子的变异 尽管内含子序列是不表达的，但它在基因的表达、转录以后的拼接加工中起着重要的作用，它的异常会影响基因的表达，或使其拼接异常，造成基因的异常表达。

4．基因的终止信号或转录修饰信号的变异 它们对基因正常转录及转录产物的正确加工影响重大，其改变会使转录过长或过短影响其寿命，修饰信号的改变，也会最终引起基因表达障碍。

5．前导序列（信号肽）基因序列的改变 分泌蛋白质和胞膜蛋白质初级产物的N端，却有15～25个氨基酸组成的前导序列（或称信号肽），其编码基因序列的变异会使这些蛋白质失去正常功能。

6．常用基因分析方法 RFLP分析方法、点印迹杂交法、PCR技术、PCR-序列分析法、PCR产物直接克隆后测序等（详见第23章）。

（二）载脂蛋白基因结构特点

人血浆中载脂蛋白的结构及功能，经过近10年的深入研究，已了解得较为清楚。大部分载脂蛋白的基因和cDNA都已得到分离和确定，其核苷酸顺序也进行了测定。除ApoAⅣ，ApoB，Apo（a）外，它们的共同特点是含有3个内含子（intron）和4个外显子（exon），其内含子插入外显子的位置大致相同，基本上按照生理功能的不同，将其加以分隔。第1个内含子把5′-末端的非翻译区和翻译区分开；第2个内含子把信号肽（signal peptide）编码和功能蛋白编码区分开；第3个内含子则把原肽编码区和成熟肽编码区分开。这些基因的第1，2，3外显子的核苷酸数量也相差无几，因为第4个外显子核苷酸数量不同而导致各种载脂蛋白基因长度不同。从生物进化角度考虑，上述载脂蛋白基因结构相似性，提示可能来源于一个共同的祖先，即ApoCⅠ基因。ApoAⅣ与其他载脂蛋白基因结构不同，它只含有3个外显子。载脂蛋白基因结构的另一特点是几个基因相接很近，定位于同一染色体的一个位点上或附近，呈紧密连锁状态。如ApoAⅠ，CⅢ和AⅣ基因位于第11号染色体长臂2区，形成一个约15kb的基因簇。还有一个紧密连锁的基因簇是ApoE，CⅠ和CⅡ基因，同位于第19号染色体长臂3区19q3（表1-2）。

表1-2　人体载脂蛋白基因的染色体定位表

（续　表）

（1）q代表长臂；p代表短臂；数字代表区段

（三）常用的载脂蛋白基因型

1．ApoE多态性 Utermann等于1975年首先观察到ApoE多态性，利用等电聚焦电泳和SDS-PAGE可以确认ApoE的多态性，其后又被直接检测的cDNA序列所证实。ApoE有3种异构体（isoform）即E2，E3和E4。有的人只含有1种主要异构体，即为纯合子；有人可含2种主要异构体，即为杂合子。由此可见，人群中可有常见的6种不同的表型。一般认为，次要异构体是由主要异构体翻译后，经唾液酸糖化修饰后转变而来。ApoE3/3型又称野生型。

人群中ApoE多态性存在种族变异，不同人群中ApoE基因型高度不同。欧洲ApoEε4等位基因频率从北到南呈下降趋势的分布。亚洲人ApoEε4频率低，相比之下，非洲人及巴布亚和新几内亚ApoEε4频率高。

由于早期观察到，ApoE2/2表型的Ⅲ型高脂蛋白血症病人在未成年即患冠心病，从此，对ApoE多态性进行了广泛研究。许多证据认为，ApoE多态性是动脉粥样硬化早期及发展过程中个体差异的主要原因。大量人群调查发现，ApoEε4等位基因的一般作用是可以显著地升高健康人的总胆固醇浓度，使之易患动脉粥样硬化。相反，ApoEε2等位基因的一般作用是降低胆固醇浓度，其降低效应是ApoEε4升高胆固醇的2～3倍。ApoE等位基因变异还与血浆ApoB浓度、三酰甘油及血管收缩压有关。现认为ApoEε2等位基因对冠状动脉硬化的发展有防护作用，经临床研究发现，患心血管疾病如心肌梗死幸存者，或血管造影证明有动脉粥样硬化者，比其对照组的ApoEε4等位基因频率高。ApoEε4/3杂合子比ApoEε3/2和ApoEε3/3基因型者发生心肌梗死年龄更年轻。ApoE多态性变异还与肾病综合征、糖尿病有关。值得重视的是ApoE多态性与老年性痴呆病（AD）的关系。

ApoE多态性按其蛋白分型称为ApoE表型，按基因分型称为ApoE基因型，二者检测结果应该是一致的。ApoE蛋白表型分型法公认是等电聚焦电泳法（IEF），这是一种从基因表达产物蛋白质水平进行分型。操作过程中，蛋白质的分离纯化，电泳染色及扫描定量等环节极易导致误差，现在较为少用。基因分型法是依据编码ApoE等位基因299个氨基酸残基的EXON 4区，设计引物，利用PCR-SSCP或RFLP或者采用特异多重PCR技术（multiple amplification refractory mutation system PCR，multi-ARMS PCR）进行分型。利用基因分析技术进行分型较为简便易行，结果准确可靠，根据湖北人群调查（1 236例）ApoE基因型频率分布，ApoEε2/2型占0．5%，ApoEε3/2型占12．1%，ε3/3型占70．4%，ε4/3型占15．0%，ε4/4型占0．9%，ε4/2型占1．3%；等位基因频率分布，ApoEε2占8．1%，ε3占83．0%，ε4占8．9%。

在研究高脂血症评定心脑血管疾病的危险因素方面，以ApoE多态性为手段进行研究有重要的临床意义。有学者认为，基因型的“坏”ε4和“好”ε2的等位基因之间的平衡，可作为基因分析应用于医学检验领域，协助临床疾病的诊断。

2．ApoCⅡ微卫星DNA多态性 依据ApoCⅡ基因内含子1区含有二核苷酸串联重复序列（TG）n（AG）m为一复合微卫星DNA序列，具有高度多态性。研究表明，ApoCⅡ微卫星DNA（TG）n（AG）m多态性与As的发生具有一定的相关性。研究报道中国湖北人群231例健康人和108例冠心病基因型有17，18，26～35共计12种等位基因，其中，冠心病组等位基因17频分布明显高于健康对照组。

3．Apo（a）基因多态性 Apo（a）仅存在于Lp（a）中，是一种高分子量的糖蛋白，其基因位点调控着Lp（a）的浓度。在基因5′端侧翼1．5kb内存在一个五核苷酸重复序列（pentanucleotide repeats，PNR）显示多态性即（TTTTA）n串联重复。研究表明，Apo（a）PNR基因多态性与血浆Lp（a）浓度与As发生有关。经153名湖北健康汉人（TTTTA）n分析，检出等位基因有4～11共7种，脑梗死患者82例分析等位基因5频率分布高于健康人群，等位基因9分布频率则低于健康人群。