细菌芽孢的培养制备

消毒监测常使用到标准试验芽孢菌株，有条件的医院或防疫部门可以自己制备细菌芽孢，现以枯草杆菌黑色变种（ATCC　9372）芽孢为例介绍培养方法。

（一）物品准备

1.培养液　普通营养肉汤，处方及制备方法可参考附录A。普通营养琼脂培养液，处方及制备方法可参考附录A。

2.无菌器材　各种规格的吸管、试管、L棒、接种环、无菌平皿、普通营养琼脂培养液罗氏瓶、带玻璃珠的三角烧瓶等无菌室用品。

3.必需的设备　冰箱、培养用恒温培养箱、离心机、显微镜等。

（二）接种培养

1.分离纯化培养

（1）接种增菌培养：取标准冻干菌种管，用碘酒和乙醇消毒菌种管尖端，无菌条件下打开菌种管用毛细管吸取少量营养肉汤注入菌种管内融化冻干菌种，取出少量接种到无菌肉汤管内。

（2）肉汤增菌：于37℃（嗜热脂肪杆菌为56℃）温箱内培养24h，为第1代增菌肉汤培养物。

（3）分离接种纯培养：用接种环取肉汤培养物在营养琼脂平板上划线分离，于37℃（嗜热脂肪杆菌为56℃）培养24h，生长形成有单个菌落，此为第2代培养物。

（4）制备接种菌悬液：用无菌接种环选取典型菌落接种到营养肉汤管内（视需要可接种数管），置于37℃温箱内培养24h，此为第3代增菌液。

2.培养芽孢

（1）接种罗氏瓶：取第3代增菌液接种到营养琼脂（嗜热脂肪杆菌芽孢培养液内尚需要加入特殊营养素及钙镁离子等）培养液上（平板或罗氏瓶），让菌液能均匀漫过培养液所有表面，平放10min以上吸出多余的菌液，置于37℃（嗜热脂肪杆菌为56℃）温箱内培养3～5d。

（2）染色镜检：检查细菌芽孢形成率。取少许菌苔做玻璃片涂片，用芽孢染色法（孔雀绿染色芽孢显绿色）染色，于显微镜下检查芽孢形成率能达到90%以上即可收取。

（3）收取芽孢：①向每个培养皿内加入10ml无菌蒸馏水（罗氏瓶需要加入20ml），用灭菌的L棒轻轻刮下菌苔，然后用吸管将其吸入到无菌三角瓶内。②溶菌断链。将三角瓶内芽孢液振摇5min，置于45℃水浴中24h，然后用4层无菌纱布过滤芽孢液除去琼脂残渣。

（4）离心清洗：将过滤后的芽孢液分装在无菌离心管内加盖，置于离心机内以3　000r／min，离心30min，弃去上清液，再加入无菌蒸馏水重新悬浮离心，如此反复离心3次，最后再加入无菌蒸馏水悬浮起来即成为芽孢液，移入带玻璃珠的三角瓶内。

（5）灭活繁殖体：①加热灭活法。将带玻璃珠芽孢液三角瓶置于80℃或60℃水浴中灭活10min或30min，嗜热脂肪杆菌芽孢可用100℃水浴灭活5min，杀灭繁殖体。冷却后放入4℃冰箱放置1周，再重新按上述方法离心清洗3次，然后重新用无菌蒸馏水将离心沉淀的细菌芽孢制成芽孢悬液。对芽孢悬液做活菌计数，放入带玻璃珠的无菌玻璃瓶内，标明含菌量、制备日期、细菌名称等，保存4℃冰箱内备用。②酶溶灭活处理法。将收获并经离心清洗后的细菌芽孢用0.03mol／L PBS制成芽孢悬液，然后加入溶菌酶进行消化作用，再经3　000r／min，离心30min。对细菌芽孢沉淀物用无菌蒸馏水反复离心清洗3次，然后将沉淀物用无菌蒸馏水制成芽孢悬液，按上述方法进行活菌计数，标记储存于4℃备用。