（一）清除标准
（1）可有效清除残余消毒剂。
（2）对试验微生物无害，不影响受损伤微生物的复苏。
（3）不影响载体上微生物洗脱，不减少细菌回收量。
（4）对培养液营养成分不产生拮抗作用，不影响液体培养液的透明度。
（5）病毒灭活试验用中和剂对培养病毒的细胞无害，不破坏细胞营养液的成分。
（6）不干扰细菌和病毒检测方法的灵敏度。
（二）化学中和法清除试验
【试验准备】
准备好所需中和剂和其他培养液、试剂，以及无菌器材。设计试验组及其作用见表29-3。
【操作步骤】
1.悬液定量法中和剂试验
（1）全部试验：应在18～22℃之间进行。
（2）第1组：先在消毒剂试管内加入菌悬液立即混匀，作用到规定时间取0.5ml菌药混合液加于4.5ml稀释液试管内，取样做倾注接种到无菌平皿内。
（3）第2组：吸取菌悬液加到消毒剂试管内立即混匀，作用到规定时间取0.5ml加到4.5中和剂试管内混匀，中和作用10min后按上述程序取样接种。
（4）第3组：吸取菌悬液加到中和剂试管内混匀，中和作用10min，吸取0.5ml加到4.5ml中和剂试管内，如此连续进行10倍稀释，一般稀释10－3～10－4（原液含菌量约为105～106），取最后稀释度进行倾注接种。
（5）第4组：取消毒剂加到中和剂试管内混匀，中和作用10min后，然后加入菌悬液混匀，作用10min，再用中和剂同第3组一样进行连续10倍稀释，然后取样接种。
（6）第5组：吸取菌悬液加到稀释液试管内混匀，作用10min后，用稀释液进行连续稀释，然后取适当稀释度样接种。
（7）第6组：取无菌稀释液和中和剂接种到所用培养液内，做阴性对照组。
（8）将接种好的平皿倒入熔化冷却到45～50℃营养琼脂培养液混匀，冷却凝固后，反转置于37℃温箱内，培养24～48h，记录各平板菌落形成单位，计算出各组菌数（cfu／ml），以此来判断中和剂中和效果。
2.载体定量法中和剂试验 与悬液定量试验一致，只是在每组因子组合中以菌片代替菌悬液即可，以菌片转移代替液样转移。
【结果评定】
判定中和剂有效必须满足如下条件：第1组无菌生长或仅有少量细菌生长；第2组有菌生长并且比第1组菌数明显地多，但第2组计算杀菌率符合消毒剂最低有效浓度要求；第3、4、5组生长菌数接近并符合染菌量要求，各组间误差≤15%；第6组无菌生长；试验连续重复3次结果一致。满足上述条件，可以判定中和剂符合标准。各组试验结果的实际意义详见表29-1。
【注意事项】
1.设计完整 实验设计的各组要观察齐全，不得遗漏。各种试验条件应与实际杀菌试验一致。
2.进行预备试验 做好预备试验，选择好最低有效浓度和作用时间，准确掌握菌悬液浓度以便确定稀释度。
3.确定试验有效性 对于难以选出中和剂的复方消毒剂或中草药消毒剂，可采用血平板必要时采用动物接种法来确定是抑菌还是杀菌。
表29-1 中和剂效果鉴定实验组设计及其意义
（三）病毒灭活中和剂鉴定预备试验
在我国现行版《消毒技术规范》中涉及到病毒灭活检验主要用细胞培养法，指标病毒用脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株（Polio-Ⅰ）。
【设计】
（1）中和剂＋细胞进行培养（观察中和剂对细胞的影响）。
（2）消毒剂＋中和剂＋细胞（观察中和产物对细胞的影响）。
（3）消毒剂＋细胞进行培养（观察消毒剂对细胞生长的影响最低浓度）。
【操作步骤】
第1组：将试验用细胞分别加入不同稀释度的中和剂中，3～4h后吸出液体，再加入细胞维持液，置于37℃二氧化碳孵箱内培养。
第2组：将试验用细胞分别加入不同稀释度的中和产物中，3～4h后吸出液体，再加入细胞基础培养液，置于37℃二氧化碳孵箱内培养。
第3组：将试验用细胞分别加入不同稀释度的消毒剂中，3～4h后吸出残余消毒剂，再加入细胞维持液，置于37℃二氧化碳孵箱内培养。
【结果判断】
第1，2组细胞生长正常，第3组以细胞生长正常的消毒剂最高浓度组带入正式试验。
（四）病毒灭活中和剂鉴定正式试验
【设计】
（1）消毒剂＋病毒，作用后接种细胞培养。
（2）消毒剂＋病毒＋中和剂，作用后接种细胞培养。
（3）中和剂＋病毒悬液，接种细胞培养。
（4）消毒剂＋中和剂＋病毒悬液，接种细胞培养。
（5）病毒＋稀释液，接种细胞培养。
（6）细胞＋稀释液，接种培养。
【操作步骤】
第1组：取配制双倍浓度的消毒剂0.5ml于试管内，于20℃恒温5min，加入0.5ml病毒悬液，混匀；作用至规定时间，再加入1ml去离子水，混匀取样接种细胞培养。
第2组：取配制双倍浓度的消毒剂0.5ml于试管内，于20℃恒温5min，加入0.5ml病毒悬液，混匀；作用至规定时间，再加入1ml中和剂，作用10min后，取样接种细胞培养。
第3组：取0.5ml去离子水置于试管内，恒温水浴5min，加入0.5ml病毒悬液，混匀；再加入1ml中和剂，作用后，取样接种细胞培养。
第4组：取双倍浓度消毒剂0.5ml置于试管内，恒温水浴5min，加入1ml中和剂混匀作用10min；再加入0.5ml病毒悬液，作用10min后，取样接种细胞培养。
第5组：取去离子水1.5ml于试管内，恒温5min，再加入病毒悬液0.5ml，混匀；取样接种细胞培养。
第6组：取细胞接种维持液培养。
【结果判断】
第1组无病毒生长或有少量生长；第2组有病毒生长；第3、4、5组病毒生长与原接种量一致；第6组细胞生长正常。所选择中和剂符合要求。
（五）过滤冲洗法清除试验
过滤冲洗法清除残余消毒剂属于物理方法，主要用于化学中和法效果不理想的消毒剂杀菌试验。过滤冲洗法的原理是利用特殊制备的稀释冲洗液（一般使用磷酸盐缓冲液或生理盐水，再加入低浓度（5～10g／L）吐温-80）反复清洗吸附在菌体表面上的残余消毒剂，然后将被阻留在滤膜上的细菌连同滤膜贴在营养琼脂培养液上培养，进行活菌计数。
【试验材料】
用漏斗式滤器和孔径在0.44μm微孔滤膜，灭菌后使用；真空泵或水抽滤泵；无菌稀释液或冲洗液（多用含5g／L吐温-80的磷酸盐缓冲液或生理盐水）；常规无菌器材和培养液。
【操作步骤】
全部试验必须控制在20℃±1℃水浴条件下，应在预备试验基础上消毒剂控制在最低有效剂量条件下，其他条件也必须符合实际杀菌试验。
第1组：在无菌试管内加入1.0ml试验浓度的菌悬液（视设计要求加或不加有机干扰物），恒温后再加入4.0ml试验浓度1.25倍浓度的消毒液，立即混匀。作用至规定时间，振荡混匀后取出0.5ml样液，加入到盛有4.5ml稀释液的试管内。充分混匀后，取稀释样液接种无菌平皿，倒入熔化的营养琼脂，做活菌计数培养。
第2组：在无菌试管内加入1.0ml试验浓度的菌悬液（视设计要求加或不加有机干扰物），恒温后再加入4.0ml试验浓度1.25倍浓度的消毒液，立即混匀。作用至规定时间，将全部样液倒入已经连接好的滤器内的滤膜上，启动真空泵进行抽滤至样液被抽干；再加入5ml冲洗液抽干，反复3次抽滤冲洗。将滤膜有菌面朝上贴于营养琼脂培养液平板表面进行培养后活菌计数。
第3组：在无菌试管内加入1.0ml试验浓度的菌悬液（视设计要求加或不加有机干扰物），再加入4.0ml无菌硬水混匀。不加消毒液，但需作用至规定时间，取样液进行系列10倍稀释，使试管内总菌数在300以下，按上述方法进行抽滤。然后将滤膜有菌面朝上贴于营养琼脂培养液平板表面进行培养后活菌计数。
第4组：在无菌试管内加入1.0ml菌悬液，然后加入4.0ml冲洗液，立即混匀。不加消毒液，直接对其进行系列稀释，取样液接种，进行活菌计数，作为阳性对照组。
【结果判断】
第1组无菌生长，或仅有少数细菌；第2组有菌生长且较第1组菌数明显增多，但菌数明显少于第3、4组；第3组生长菌数与第4组菌数一致；第4组菌数应为1×107～5× 107cfu／ml。若各组菌数符合上述要求，且连续3次重复试验结果一致，说明使用过滤冲洗法能有效清除残余消毒剂。
（六）试验组设计及其意义
见表29-2。
表29-2 中和剂试验各组操作及其意义
（七）试验要求
1.综合分析结果 认真分析试验结果是否符合设计要求，得出清除残余消毒剂的效果、试验菌生长的恢复、恢复培养液是否受到影响等关键结果的结论。
2.试验消毒剂浓度 要选择有效临界浓度和最短作用时间，因为浓度过高把细菌全部杀灭，第2组试验总是无菌生长无法进行中和剂鉴定试验，作用时间最短不得少于30s，否则无法控制试验作用时间；浓度过低不能代表试验中最高试验消毒剂浓度，作用时间最长不得超过实际杀菌所需时间。
3.试验代表菌 过滤冲洗法所用指标菌要包括该消毒剂试验涉及所有细菌种类代表，细菌繁殖体可任选其中一种作代表，但涉及到细菌芽孢、真菌或分枝杆菌，则均需要纳入试验，不得以细菌芽孢作代表，也不可用繁殖体作整个试验菌代表。
4.试验方法代表 过滤冲洗法中，悬液定量试验法选择中和剂的结果可以用于载体定量法，但载体定量法选择的中和剂结果不可简单用于悬液定量法，需要进行验证试验。
5.载体定量法试验 载体定量杀菌试验中用过滤冲洗法清除残余消毒剂，试验方法程序与悬液定量法相同，只是把菌悬液替换成染菌载体。
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