抑菌环试验

抑菌环试验通过抑菌环大小判断抗菌药物（包括消毒产品）是否具有抑菌能力的试验。抑菌环试验是利用含抑菌剂的试验纸片不断溶解并能在琼脂培养液中扩散，在抑菌剂扩散范围内细菌不能生长而显示出无菌生长带的原理，然后精确量取无菌生长带的直径来判断抑菌环大小，确定抑菌效果。多用于对溶出性抑菌剂和含有溶出性抑菌剂产品，包括抗菌布、抗菌肥皂等的鉴定。

【试验准备】

1.试验菌种　金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（ATCC　8099）、白色念珠菌（ATCC　10231）或根据抑菌剂特性选用其他细菌制成菌悬液。

2.制备抑菌片　取直径5mm的圆形的新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120℃烤干2h，每4片一叠，滴加实际使用浓度的抑菌剂溶液20ml。将滤纸片分开，平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱（37℃）烘干或置室温下自然干燥，备用。对含可溶出性抗菌产品，直接制成直径5mm的圆片（块），每4片一组。

3.制备阴性对照样片　取无菌干燥滤纸片，每叠4片，滴加无菌蒸馏水20ml，烘干后备用。溶出性抗菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成分的样品，制成与试验组大小相同的样片（块）。

4.培养液的准备　营养琼脂培养液，真菌用沙堡琼脂培养液。

5.试验器具　微量移液器（5～50ml，可调式），游标卡尺，活菌培养计数所需器材。

【操作步骤】

1.接种试验菌　用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105～5×106cfu／ml的试验菌液，在营养琼脂培养液平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周（达到近融合生长）。盖好平皿，置室温干燥5min。

2.贴放抑菌片　用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上，贴放好后，用无菌镊子轻压菌片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37℃温箱，培养16～18h，观察结果。每次试验，贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验菌片，1片阴性对照样片，共5片。

3.测量抑菌环　用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。试验要重复3次。

【结果判断】

抑菌环直径＞7mm者、阴性对照组应无抑菌环产生判为有抑菌作用，3次重复试验均达有抑菌作用者，判为合格；抑菌环直径≤7mm者，判为无抑菌作用。阴性对照若显示出抑菌环，则试验无效。

【注意事项】

（1）每次试验均应设阴性对照，不可省略，在报道中应列出对照组的结果。

（2）接种用细菌悬液的浓度应符合要求。应按本书第23章第二节细菌繁殖体悬液的配制方法进行。浓度过低或过高、接种菌量过少或过多，都会直接影响抑菌环大小而导致结果不准确。

（3）应保持琼脂浓度的准确性，否则也可影响抑菌环的大小。

（4）培养时间不得超过18h，培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。

（5）抑菌环直径可受抑菌剂药量、药效和干湿度影响，因此，抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。