（一）鲎试剂检测试验（凝胶）法
本法利用鲎试剂（鲎变形细胞裂解物）与细菌内毒素产生凝集反应的原理，以判断供试品中细菌内毒素限量的一种方法。具有灵敏度高，反应快，准确可靠等特点。内毒素使用单位用内毒素单位（EU）表示。
【基本原理】
鲎为海洋生物，由于其血中存在能携氧的含铜血蓝蛋白（hemocyanic）而呈蓝色。鲎血仅有一种血细胞，称变形细胞。细胞浆中含有大量致密的颗粒。颗粒中含有与细菌内毒素起凝集作用的酶系统，即凝固蛋白质（coagulagen）、凝固酶原（proclotting enzyme）、B因子、C因子。细菌内毒素可使C因子激活，激活的C因子又将B因子激活，其又使凝固酶原活化成凝固酶，它通过酶解作用使凝固蛋白原转变为凝固蛋白。凝固蛋白又通过交联酶作用，相互聚合形成纤维状的凝胶。
鲎血变形细胞中还有一种酶，称G因子。它在凝固酶原作用下，可与真菌细胞壁一些成分产生凝集作用而形成假阳性。为保证鲎试剂的灵敏性和准确性，现生产的鲎试剂已去掉了变形细胞中的G因子，从而为定性或定量检测细菌内毒素试验提供了可靠的基础。
【试验准备】
1.试验设备 有电热干烤箱、恒温水浴箱。细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
2.试剂
（1）工作标准品：以细菌内毒素国家标准品为基础标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU。
（2）检查用水：指与灵敏度为0.03EU／ml或更高灵敏度的鲎试剂，在37℃±1℃条件下24h不产生凝集反应的灭菌注射用水。
3.试验器材 试验用的吸管、烧瓶、注射器、试管等一律除去可能存在的外源性内毒素。玻璃器具可先用重铬酸钾洗液浸泡、再用无热源蒸馏水冲洗干净，置于干烤箱180℃，干烤2h或250℃干烤30～60min。塑料制品置30%过氧化氢或3%盐酸溶液中浸泡4h，再用无热源水冲洗后于60℃烘干备用。
4.鲎试剂灵敏度复核
（1）实验前应对使用批号的鲎试剂做灵敏度测定，并符合规定。鲎试剂灵敏度定义为在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品中的最低内毒素浓度，用EU／ml表示。
（2）根据鲎试剂灵敏度的标示值（λb），将细菌内毒素国家标准品或工作标准品，用细菌内毒素检查用水（或无热源水）溶解，在漩涡混合器上混合15min，然后制备成2倍稀释度，即2λb、λb、0.5λb、0.25λb四个浓度的内毒素标准液备用。每稀释一步，均应在漩涡混合器上混合30s，按”检查法”项下试验，每一稀释液平行做4管。如最大浓度4管均为阳性，最低浓度4管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度测定值（λc）。
λc＝Log－1（Σχ／4）X为反应终点内毒素浓度的对数值。
当λc在0.5～2.0λb（包括0.5λb和2.0λb）时，方可用于细菌内毒素检查并以λb为该批鲎试剂的灵敏度。每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。
5.供试品干扰试验 准备同一批号至少3个供试品。在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml无热源水，输血器腔内注入15ml无热源水，反复荡洗5次后，两端密封，置37℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至无菌无热源的有塞玻璃容器内，储存不超过2h，液体药品可直接在无菌操作技术下抽取。
本试验用于对细菌内毒素试验所用物品（包括无热源水、试剂、器具等）的检测，要求其所含内毒素不可被检出。同时也用于证明被检验的制品（药液、生物制品等）及其成分不干扰细菌内毒素试验，以保证试验结果的准确。
供试品干扰试验按鲎试剂灵敏度复核试验各项之下，使用内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数的稀释液分别将同一支细菌内毒素国家标准品或工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2λb、λb、0.5λb、0.25λb四种浓度的内毒素稀释液。用细菌内毒素检查用水和用供试品溶液或其他稀释液制成的每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和供试品溶液过其稀释液各做2支阴性对照管。如最大浓度2λb管均为阳性，最低浓度0.25λb管均为阴性，且阴性对照管均为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准液的反应终点浓度的几何平均值（E）和用供试品溶液过其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（E）。
Es＝lg－1（∑Xs／4）
Et＝lg－1（∑Xt／4）
式中Xs、Xt分别代表内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。当Es在0.5～2λb含两端值范围时，且Et在0.5λb和2λb时，则该供试品在该浓度下不干扰试验，否则需使用更灵敏的鲎试剂。如鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺发生变化时，必须重新进行干扰试验。对供试品进行更大倍数稀释，使用更高的鲎试剂灵敏度，是排除干扰因素的简单有效的方法。
供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：
MVD＝CL／λb
式中：L为供试品的细菌内毒素限值，C为供试品溶液浓度，单位为EU／ml时，C为1.0ml／ml。
【操作步骤】
（1）取装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管（或0.1ml／支规格的鲎试剂原安瓿）5支，其中2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，1支加入2λb内毒素工作标准品溶液0.1ml作为阳性对照管，1支加入细菌内毒素检查用水0.1ml作为阴性对照管，最后1支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（是用被测供试品溶液将同一支细菌内毒素工作标准品制成2λb浓度的内毒素溶液）。
（2）将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入（37±1）℃水浴中，恒温水浴保持（60±2）min，轻轻取出，观察结果。
【结果判断】
1.取出观察 将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°管内容物呈坚实凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）。不呈凝胶或虽呈凝胶，但不能保持完整者为阴性，记录为（－）。
2.结果观察 2支供试品管均为（－）者应认为符合规定，供试品2管均为（＋），应认为不符合规定；如2管中有1管为（＋），另一管为（－）时，应按上述方法另取4管供试品管复试；如4管均为（－），判定产品或药品符合规定。若阳性对照管为（－）或供试品阳性对照管为（－）或阴性对照管为（＋），则试验无效。
【注意事项】
（1）从恒温器中拿取试管过程中应避免受到振动造成假阴性结果。
（2）试验所用物品（器具、溶液、稀释液、洗脱液及其提取物）应无菌、无热源、经干扰试验证明本身不对细菌内毒素具有抑制或增强作用。
（3）蛋白变性剂、洗涤剂、部分巯基化合物、螯合剂、高浓度盐溶液等对本试验均有干扰，因此，预先要做干扰试验。
（4）鲎试验最佳pH6.25～7.25。pH＜4或＞8，凝胶反应会被阻止。因此，制备供试品溶液，其pH可调至6.0～8.0。可用不含细菌内毒素的0.1mol／L的盐酸液或氢氧化钠液调节。
（5）温度应控制在37℃±1℃。温度过低，凝胶化会推迟。过高，凝胶化会被阻止。
（6）每次试验，应将有关检查试验项目、数据及结果进行认真登记。
（二）热源检查家兔试验法
热源检查家兔试验法为最经典方法，本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热源的限度是否符合规定。
【基本原理】
人体对内毒素的病理作用最为敏感，2μg／kg体重的剂量就可引起发热反应。按每公斤体内的最小致热剂量比较，家兔和人基本相当，热反应阀值也基本一致。但热反应延滞期（自静脉注射内毒素之后到热源反应发生之前的时间），家兔比人稍快即人类为45～90min，家兔为15～30min；有效剂量的内毒素能在家兔身上诱发典型的双峰热，第1峰为1～2h，第2峰于3～4h，有利于试验观察。因此，家兔热源试验结合鲎试验法可算是检测天然内毒素和热源质的最佳方法。
【试验准备】
1.试验家兔
（1）供试用的家兔应健康，且无外伤，体重1.7～3.0kg，雌兔应无孕。预测体温前7d即应用同一饲料饲养。在此期间，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等正常。
（2）选择动物均应在检查供试品前3～7d内预测体温，进行挑选。选择范围：①对未经使用于热源检查的家兔；②符合供试品规定，但组内升温达0.6℃的家兔；③判为不合格，但组内家兔平均升温未达0.8℃，并且已休息2周以上的家兔；④3周内未曾使用的家兔。挑选条件与供试品家兔相同，仅不注射药液，每隔30min测量体温1次，共测8次，8次体温均为38.0～39.6℃，且最高最低体温的差数不超过0.4℃的家兔，方可供热源检查用。
（3）用于热源检查后的家兔，作为供试品判为合格，至少也应休息2d方可供第2次检查用。如作为供试品判为不合格，且其组内家兔平均升温达0.8℃或更高时，则组内全部家兔不再使用。每一家兔的使用次数，不应超过10次。
（4）在做热源检查前1～2d，家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得＞5℃，实验室的温度应在17～28℃。试验全过程，应注意室温变化不得大于3℃，并注意避免噪声干扰。
（5）家兔在试验前至少1h开始停食并置于适宜的装置中，直至试验完毕。
（6）家兔体温应用精密度为±0.1℃的肛温计，或其他同样精确的测温装置。肛温计插入肛门的深度和时间，各兔应相同。深度一般约6cm，时间不少于1.5min。每隔30～60min测量1次，一般重复测量2次，2次体温之差不得超过0.2℃。并以此2次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃范围内，且各免间正常体温之差不得超过1℃。
2.试验用器具 注射器、针头及一切和供试品溶液接触的器皿，应彻底除去热源。
【操作步骤】
取适用的家兔3只，测定其正常体温后15min以内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38℃的供试品溶液，然后每隔30min按前法测量其体温1次，共测3次，以3次体温中最高的1次减去正常体温，即为该免体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔体温升高均低于0.6℃，但升高的总数达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。
【结果判断】
（1）在初试的3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总数低于1.4℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或体温升高至0.6℃以上的家兔仅有1只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总数≤3.5℃，均认为供试品的热源检查符合规定。
（2）在初试的3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的兔数超过1只；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的兔数超过1只；或在初试、复试合并8只家兔的体温升高总数超过3.5℃，均认为供试品的热源检查不符合规定。
（易 滨 杨华明）
参考文献
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