反转录法检测

反转录PCR（RT-PCR）方法是通过扩增肿瘤细胞标志物基因mRNA的方法检测组织或血液存在的肿瘤细胞。由于肿瘤细胞转移潜能的获得首先要经过多种基因不可逆的突变，而且这种突变在肿瘤细胞克隆中表达均一、稳定，因此，RT-PCR检测肿瘤基因标志物是目前最适于发现肿瘤早期转移的方法。RT-PCR法用于检测基因标志物，其灵敏度可达107～109。

外周血中肿瘤细胞的主要标记基因有：细胞角蛋白19（CK19mRNA）和20（CK20mRNA），用于检测上皮性恶性肿瘤；癌胚抗原（CEA mRNA）用于结肠癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等CEA分泌性肿瘤的检测；甲胎蛋白（AFP mRNA）用于肝细胞癌微转移的检测。

近年来已广为应用的Access RT-PCR系统，是用于总RNA或mRNA的检测，对特异RNA模板进行反转录（RT）和聚合酶链式扩增（PCR）。这一系统在单个管子中，使用2个酶，可对微量的RNA进行灵敏、快速、可重复的分析。这一系统使用禽类成髓细胞瘤病毒的反转录酶合成cDNA的第1条链，用来自黄栖热菌的热稳定Tf1DNA聚合酶合成cDNA的第2条链，PCR扩增DNA。Access RT-PCR系统的优点是可在单个管子中完成反应，不需要对反应混合物作任何添加，同一般常用方法相比，缩短了操作时间，减少了污染反应混合物的机会。同单酶反应相比较，即用rTthDNA聚合酶对总RNA中的目标RNA作扩增，双酶反应更灵敏。

已建立以TaqMan技术原理为基础的实时定量RT-PCR技术。有作者报道，检测14例慢性粒细胞白血病（CML）患者共22份外周血和骨髓样本中bcr-abl融合基因表达水平，并动态观察2例异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT）后复发患者bcr-abl表达量。结果：bcr-abl及GAPDH校正曲线的相关系数均为0．999，灵敏度为10-6；14例初诊患者定量RT-PCR检测值为2．81～145．00，2例Allo-HSCT后复发患者的bcr-abl mRNA表达水平与临床疾病进展相一致；检测14例患者的14对骨髓和外周血标本，两者融合基因表达水平一致。此外已有荧光定量RT-PCR方法，该方法灵敏、特异性、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于统一标准。荧光定量RT-PCR方法在CML诊断、疗效和预后判断及MRD的动态观察等方面有广泛的应用前景。由于几乎所有的CML患者都能查出bcr-abl融合基因，对其进行检测有助于CML的诊断，而且bcr-abl融合基因阴转已成为CML疗效和预后判断的重要指标。