软骨细胞移植术

随着组织工程技术和细胞培养技术的不断发展，对于软骨缺损的治疗人们逐渐将目光由骨软骨移植转向了软骨细胞移植的领域，目前应用于临床的软骨细胞移植术主要为自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI 或 autologous chondrocyte transplantation, ACT），ACI技术的发展主要经过了3个主要阶段。

（一）传统ACI技术

1968年Chesterman和Smith首次利用体外培养的软骨细胞修复骨松质和关节软骨缺损，这应该算是ACI技术的萌芽。1987年，Grande等用兔进行ACI动物实验，将体外培养的自体软骨细胞种植于兔子的膝关节软骨缺损处并用骨膜片覆盖固定，对照组仅缝合骨膜片而不移植软骨细胞。6周后发现在实验组软骨重建达82%，而空白对照组仅为18%。结论认为自体软骨细胞移植修复了关节软骨缺损。首次将ACI用于临床的是瑞典人Peterson。1987年，Peterson在哥特堡采用ACI技术治疗关节软骨缺损患者，这也是细胞工程技术首次用于骨科手术。1997年8月22日，美国FDA批准Genzyme公司将自体软骨细胞作为一种生物制剂进行体外培养，商品名为Carticel，ACI是首批用于临床的骨科生物技术之一，此后ACI的临床应用走上规范化道路。

1.原理　ACI技术的基本原理和方法是将体外扩增的软骨细胞种植于软骨缺损处，种植的软骨细胞形成新的软骨及基质来填充缺损（图4-4-9）。其作用机制为：首先种植的软骨细胞在缺损处聚集并产生新的软骨基质，骨膜片对水溶液起封闭作用，使软骨细胞分裂、分化，充填缺损处；其次骨膜内有生长因子促进种植的软骨细胞分裂；再次移植物和骨膜片刺激了邻近的软骨细胞，使之进入缺损处并进行修复。另外，固定用骨膜片还起到半透膜作用，允许从滑液来的营养物质种植的软骨细胞。

图4-4-9　传统ACI手术原理

2.适应证与禁忌证　适用于由外伤或剥脱性骨软骨炎所导致的股骨髁、滑车局限性全层软骨或骨软骨缺损。患者一般选择年龄在15～55岁，且膝关节无骨性关节炎等改变，损伤面积在2～16cm2之间。也可修复肩关节、肘关节及踝关节等处的软骨缺损。

禁用于炎性病变所致缺损或大面积的软骨面缺损。另外，ACI的疗效与软骨缺损的部位有关：股骨髁软骨缺损疗效最好，髌骨和滑车软骨损伤疗效较差。

3.供区选择　取细胞的部位一般选择股骨髁间窝的非负重区，而骨膜一般选择患侧的胫骨近端。

4.手术方法　传统ACI手术一般分3步。

（1）细胞提取：用关节镜检查缺损部位，在患膝的股骨髁间窝的非负重区切取适量的正常软骨片（一般100～300mg的关节软骨在体外培养4～5周后，可产生足够的软骨细胞来填充4～6cm2的缺损），放于常温下含有特殊培养液的无菌试管中送至细胞培养实验室。

（2）细胞培养：切碎软骨片并冲洗2次，再经过消化，分离出纯软骨细胞，然后接种、培养、增殖。

（3）细胞移植：切开关节，清理软骨缺损部位，避免穿透软骨下骨而引发创面出血，测量缺损大小和形状。然后从胫骨近端取下一片面积较缺损区稍大的骨膜片，将其按缺损的形状修整。确认缺损区无出血后，将骨膜的生发层朝向骨面覆盖缺损处，用可吸收缝线将其缝合至缺损区周围软骨上，缝合处用纤维胶封盖。将体外培养的软骨细胞悬液从预留的缺口处注入，闭合缺损，逐层缝合伤口，弹性绷带包扎（图4-4-10）。

图4-4-10　传统ACI手术过程

"A.清理；B.缝合；C.注射

5.术后康复　手术完成后，制定详细的康复训练计划非常重要。康复训练计划要根据患者的状况与需求、软骨损伤的大小、部位以及是否合并其他手术治疗等不同情况而制定。一般术后6～24h开始进行膝关节持续被动活动。对于股骨髁软骨损伤， 活动范围一般为0°～45°，滑车损伤为0°～30°。前2周每天锻炼8～10h，活动范围可逐日递增5°～10°，但屈曲不能超过90°。前6～8周为非负重期，随后10～12周可以逐渐增加负重至完全负重。术后9～10个月可进行跑步锻炼，而一些高强度活动要到术后12～15个月才可进行。术后锻炼主要有3个目的：①通过逐步增加活动度的训练促进软骨细胞再生，减少关节粘连；②为了防止骨膜承受过大负荷和移植物中心退变、分层，术后6周尽量避免负重；③通过肌肉等长训练来阻止肌肉萎缩和加强肌肉张力。

6.影响预后的因素　软骨缺损的形状、面积大小、深度、部位及患者年龄、身体状况，以及术后康复训练等因素均对预后有着不同程度的影响。

7.优势与不足

（1）优势：与前两种手术方法相比，用ACI技术治疗单纯软骨缺损在缓解症状和重建膝关节功能上非常有效，大部分病人在12～18个月重新开始体育运动；而且不仅临床症状得到明显改善，关节镜活检显示新生软骨的强度达到正常软骨的90%甚至更高，偏振光及碱性红染色均证明其具有透明样软骨特性，Ⅱ型胶原免疫染色（＋）。

（2）不足：虽然ACI一度成为国外治疗关节软骨大面积缺损的主要方法，但是，在长期的临床应用中，它的缺点也慢慢显露，这些缺点几乎都是因为ACI使用了自体骨膜瓣所致。

①ACI 中移植的骨膜可生成透明软骨样组织，但其生物力学性能、耐磨持久性不佳，易退变；而且依靠的是先质细胞（precursor）向软骨组织的分化。先质细胞如间充质干细胞一样具多向分化性，可分化生成脂肪细胞、骨细胞等，从而使新生组织性能不佳。

②骨膜肥大，骨膜增生所形成的指样突起进入关节腔，往往需要关节镜再次切除；移植的软骨细胞悬液可能从植入区向外渗露。

③ACI 中骨膜供体的选择、缝合以及缺损位置、深度都对移植后的骨膜能否顺利生成软骨组织有一定影响，整个手术过程操作非常复杂，对外科医生手术技巧要求较高，从而阻碍了该技术的推广。

④有些患者的自体骨膜过于菲薄，或者脆弱，容易破裂，影响手术效果。

⑤ACI 手术中移植的骨膜可以使软骨下骨密度增加，增加了新生软骨组织承受的应力，从而导致新生软骨组织的退化。

⑥骨膜虽经缝合固定，但仍然有脱落可能。植入区内的细胞在重力等原因影响下会分布不均，从而使再生的软骨面不平整。

（二）对传统ACI技术的改进

由于传统ACI的缺陷主要是由于利用自体骨膜瓣作为封闭材料导致的，那么对ACI的改进就把重点放在了寻找替代骨膜瓣的材料上。德国Verigen公司的科学家最终选择了Ⅰ/Ⅲ型双层胶原膜作为新的封闭材料。由于旧的ACI采用骨膜（periosteum），因此称作ACI-P；新方法使用胶原膜（collagen），因此就被称作ACI-C（或者CACI），即第2代自体软骨细胞移植技术。ACI-C与ACI-P的区别只是用胶原膜替代了骨膜瓣，胶原膜仍然是用缝合的方法结合到病灶周围，封闭软骨细胞移植区域。胶原膜由猪皮制成，抗原性极低，在人体内可以完全降解，完全符合优良的组织工程支架材料的要求。

但是，缝合这种方式本身却存在与生俱有的弊端：操作复杂，同时对周围健康软骨造成创伤。另外，将细胞悬液注射到缺损局部往往出现细胞流失及分布不均，这也是需要改进的地方。

（三）基质诱导的自体软骨细胞移植（matrix-induced autologous chondrocyte implantation, MACI）技术

1998年MACI技术开始用于临床。 Behrens在1999年首先报道了MACI技术。2001年德国Verigen公司用类似的技术注册了专利并以MACI作为其商标。目前MACI广泛用于欧洲、澳大利亚。近来，亚洲、美国也在逐步推广应用这项技术。2004年12月17日北京武警总医院骨科完成国内首例MACI手术，到目前为止，已治疗了7例病人、9个关节共16处缺损，随访效果满意。半年后患者各项症状消失，已能参加日常轻体力工作。术后半年关节镜复查显示原有关节软骨缺损已被新生软骨组织填充，新生软骨色泽、硬度及与周围软骨整合度均满意。

1.原理　在关节镜下采集少量患膝非负重区自体软骨组织，体外分离出自体软骨细胞（图4-4-11），经培养扩增后，接种到Ⅰ/Ⅲ型双层胶原膜（该膜有光滑面和粗糙面）（图4-4-12）上，然后共培养数日，细胞与支架结合紧密后，胶原膜被用生物蛋白胶粘贴到关节软骨缺损病灶底部。术后进行系统的康复训练。

术后，软骨细胞从胶原膜上游离并穿过生物胶，迁徙到软骨缺损的基底部。胶原膜和生物胶逐步降解并被吸收。接种的软骨细胞在局部生长、繁殖，并分泌基质，形成新的软骨组织，逐步充填该处缺损。当缺损得到完全修复后，由于关节的活动，新生软骨的表面发生接触抑制，不再形成新的软骨组织。因此，修复软骨与周边软骨整合良好，形状与损伤前该处软骨的形状几乎完全一致。

图4-4-11　MACI技术的原理

图4-4-12　MACI膜（扫描电镜）

2.适应证与禁忌证　大致与ACI相同。另外，MACI几乎可以治疗任何关节的软骨损伤，髋关节、肘关节、腕关节，甚至指间关节都能应用，但MACI手术对于股骨髁与胫骨平台同时发生的关节软骨损伤（又称kissing lesion，因为上下关节面的缺损区能够相互接触）疗效不佳。

3.供区选择　取细胞的部位一般选择患膝的非负重区——股骨髁间窝。

4.手术方法　手术分2步进行，中间间隔4～5周。

（1）关节镜下取软骨组织（图4-4-13）：在硬膜外麻醉下施行患膝关节镜检查，术中观察内、外侧半月板是否完好，前后交叉韧带有无损伤，紧张度是否正常，确定关节软骨缺损的部位、大小和深度。关节软骨损伤按照ICRS分类进行评定。观察滑膜和关节腔滑液外观是否正常。同时采集患膝非负重区健康关节软骨50～200mg作为种子细胞来源，送实验室培养并制备MACI膜（种植了自体软骨细胞的双层胶原膜）。

图4-4-13　关节镜下软骨组织标本切取

（2）MACI膜植入术（图4-4-14）：关节镜术后5周，MACI膜制备完毕，施行MACI手术。手术在硬膜外麻醉下进行。患者平卧位，患膝屈曲约60°，根据患者缺损位置选择合适切口，进入关节腔，简单探查后刮除剥脱软骨，修整软骨缺损创面，在软骨缺损区做一试膜，以试膜为样板剪出大小形状相似的MACI膜，在修整好的缺损部位上涂生物胶后，将MACI膜的粗糙面朝向软骨缺损区，贴附并用拇指按压1min。渐伸直活动患膝关节，确认MACI膜无松动，关节活动无异常，冲洗关节腔，逐层缝合切口，加压包扎膝关节。手术时间30～60min。

5.术后处理　术后24h患膝制动于屈曲10°位并抬高患肢15°。24h后至1周之内在支具保护下小范围不负重活动患膝关节(15°以内)。术后观察2～3周无异常，患者出院。按照特定的康复计划进行循序渐进的功能锻炼（第2周至第6周去除支具，被动活动关节，范围在60°以内，同时患肢做等长收缩练习，最多负重20kg。6周后扶双腋杖行走，负重逐渐增加），随访患者并保持定期来院复查。

图4-4-14　MACI手术过程

A.切口显露；B.修整缺损；C.测量缺损；D.按缺损形状修剪膜E.注射纤维胶；F.贴膜加压固定

6.典型病例　患者王某，男，于2005年3月7日在踢球时不慎撞伤右膝关节，当时右膝关节疼痛剧烈，肿胀明显，不能行走，当地摄X线片未见异常，未做特殊处理。1月后疼痛加重，6月14日行右膝关节镜检，发现股骨内髁小块软骨缺损，并有游离体形成。将游离软骨摘除。术后行动可，右膝关节屈曲轻微受限。查体：右下肢皮肤完好，双下肢等长，右膝关节局部轻微压痛，浮髌试验（-），髌骨研磨实验（＋），右膝关节活动受限，右膝伸屈：0°～110°，左膝伸屈：0°～135°，双下肢肌力及皮肤感觉正常，双下肢膝腱反射及跟腱反射正常，双侧Babinski征（-），足背动脉搏动双侧均可触及，末梢血运循环正常。MRI检查示：矢状位T2WI-FS，右股骨内髁骨关节面下片状高信号，边界不清，信号不均，局部关节软骨面变薄，髌上囊积液（图4-4-15）；矢状位3D序列，右股骨内髁骨关节面下片状低信号，边界不清，信号不均（图4-4-16）。于2005年7月14日行关节镜检查术，术中见右股骨内髁软骨缺损，面积为2.5cm×3.0cm，且缺损缘的软骨与软骨下骨分离，有继续剥脱的倾向。取100mg软骨组织送做细胞培养。2005年8月26日行MACI手术。术后恢复良好，术后半年各项症状逐渐消失，步态正常，已经完全可以负重行走，并参加简单轻体力活动。无伤口感染、植入物脱落、皮肤坏死等并发症。术后患者IKDC2000评分增高（术前25.3，术后半年56.3，术后1年93.1）。术后10个月，复查MRI示：矢状位T2WI-FS，右股骨内髁未见明显异常，局部软骨面下骨皮质条状高信号（图4-4-17）；矢状位3D序列，右股骨内髁未见明显异常，局部关节面未见明显异常信号（图4-4-18）。患者术后1年可参加各种体育活动，并于2007年元旦期间参加了洛阳市中学生长跑比赛，取得优异成绩。恢复良好。

7.优势及不足

（1）优势：除了无需缝合，不存在细胞悬液泄漏，与传统ACI相比，MACI还具有很多优点。

①术后恢复时间短：MACI术后平均恢复时间为3周，ACI-C为4周，而ACI-P和人工关节置换的平均术后恢复时间分别为10周和12周。

图4-4-15　伤膝MRI检查矢状位T2WI-FS

图4-4-16　伤膝MRI检查矢状位3D序列

图4-4-17　伤膝MRI复查矢状位T2WI-FS

图4-4-18　伤膝MRI复查矢状位3D序列

②操作简便，创伤小：手术切口小，为5～10cm，手术操作简单，使得麻醉及手术时间都缩短，这样就降低了手术风险。另外，MACI手术还可在关节镜下实施。并且易于在特殊部位进行，这对于无论是外科医生还是患者，都是一个福音。

③MACI术后可生成更多透明软骨：骨软骨移植术和传统ACI术后新生软骨还有相当一部分是纤维软骨，而纤维软骨难以达到透明软骨所具有的生物力学性能和耐磨性。因此经过骨软骨移植术和传统ACI治疗，患者的关节软骨缺损有可能被修复，但是关节功能却打了折扣，几乎无法恢复到伤前的运动中去。这对于年轻人及运动员患者是无法接受的。而MACI术后修复缺损的新生软骨虽然也有少量纤维软骨，但以透明软骨为主（图4-4-19）。

图4-4-19　术后活检

A.大体；B.HE染色，软骨细胞呈柱状排列（10×10）

④胶原膜不易脱落：Marlovits等人的一项研究回答了生物胶固定是否牢固的问题。他们对16例接受MACI治疗的患者在术后5周左右采用高分辨率核磁共振（HMRI）进行了复查，结果显示14例完全贴附，1例部分贴附，只有1例由于操作失误发生植入膜脱落。统计学分析表明，MACI采用的生物胶完全可以达到满意的贴附率，不需要其他固定方式辅助。

⑤在MACI手术时同时进行植骨效果好：对于深度超过10mm的关节软骨缺损，往往在手术时需要植骨来填补软骨下骨质缺损。Bartlett等人的研究结果显示，在MACI手术时同时进行植骨效果非常好。他们共治疗8例膝关节软骨缺损患者，术后6个月及1年的膝关节功能评分每次都有提升。1年之后所有患者认为疗效为“优”。

⑥MACI所用的生物蛋白胶不但具有固定胶原膜的作用，而且胶原膜上的软骨细胞可以自由穿过生物蛋白胶而进入缺损部位（图4-4-20），而且在植入后会像胶原膜一样自行降解，无副作用。

图4-4-20　软骨细胞穿过生物蛋白胶

（2）虽然MACI手术目前被证实临床效果很好，但仍存在以下不足：①需要以活检方式采集种子细胞,给患者增加痛苦;②细胞培养周期长（约4周）;③康复期长（约1年）;④费用昂贵（每例手术需人民币5万～6万元）；⑤新生成的透明软骨细胞远期是否有发生肥大并向纤维软骨转化的倾向尚有待于观察。

8.展望　目前自体软骨细胞移植技术的研究在欧洲最为活跃，德国、英国、丹麦、荷兰、瑞典、美国等多个国家的众多公司竞相开发更有效、更安全、更方便的关节软骨修复技术。组织工程化工程技术治疗关节软骨缺损已经显现了令人鼓舞的优势，但还要面临防止体外细胞老化加速或恶性转化率的升高、移植物本身对机体长期效果、修复后组织的生物力学特性以及在基因治疗过程中预防突变型基因表达等问题。

关节软骨缺损的治疗目标应该是：缓解症状，阻止发生OA，修复透明软骨。因此ACI发展方向非常正确。理想的软骨缺损治疗方法应该是只需一步就能完成，手术操作简单，创伤小，最好经过关节镜就能完成，并且修复效果持久满意。从患者角度考虑，新技术还必须在医疗保险承保范围之内，康复训练时间要短，并发症少或者没有。

MACI的改进应该从3方面入手：

（1）种子细胞、培养及其调控

①探索新的种子细胞来源：Wakitani等人用骨髓间充质细胞代替自体软骨细胞进行ACI 手术，治疗24 例膝关节软骨损伤患者，结果提示骨髓间充质细胞可以作为ACI的种子细胞来治疗关节软骨缺损。另外，由于软骨细胞抗原性较弱，探索利用异体软骨细胞来代替自体软骨细胞植入，不失为一种可行的方法。

②综合最优培养模式：在培养方法上，可以应用生物反应器结合藻酸盐串珠的三维培养方式代替平面培养以加快细胞增殖速度并防止表型变异。

③组合各种调控因素：体外培养软骨细胞时加入以下某种或者数种生长因子以增强细胞活力，加快细胞增殖：碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、转化生长因子β（TGF-β）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、软骨细胞生长因子（CDGF）、EGF等。从文献中可以看出，尤以前3种生长因子的调控功能最为重要。还有学者证明低氧气氛的培养更能保持软骨细胞的表型甚至促进已去分化的软骨细胞再分化。因此，尝试用低氧浓度替换传统的5%二氧化碳加空气的培养环境或许是一种更好的方法。

（2）支架材料：理想的支架，不仅可以减少种子细胞的流失和死亡，还可以促进细胞的迁移、分化和增殖。目前MACI使用的支架材料为Ⅰ/Ⅲ型双层胶原膜，该膜造价昂贵（每平方厘米约100美元），工艺复杂，限制了植入膜的产量及患者接受程度。随着生物工程技术的发展，将来必然会出现更廉价、更易制造、性能更好、储运条件更宽松的支架材料。

（3）基因技术：基因治疗的兴起也为软骨细胞移植提示了新的方向。现在已经可以在体外培养阶段向软骨细胞中转导特定基因。因此，可以预测，利用基因技术来改善甚至消除异体软骨细胞的抗原性，同时提高细胞的扩增数量，从而将自体软骨细胞移植发展到异体软骨细胞移植。未来的研究将结合细胞、基质、生长因子、生物材料等多种因素，提高关节软骨缺损的修复质量。相信随着研究的深入，ACI技术会得到进一步完善。相信不久的将来，就会有比MACI更好的产品问世，关节软骨损伤的治疗会有一个更加光辉灿烂的明天。