细胞凋亡的检测方法

检测细胞凋亡的方法很多，归纳起来可分为形态学、生物化学以及流式细胞仪三类主要检测方法。需要说明的是各种检测技术各具优缺点，应根据实验条件和实验目的选择，或多种方法综合应用，以获得可靠的结果。

1．形态学观察　一般认为形态学观察是判断有无细胞凋亡的基础，特别是光学显微镜检查，应作为常规方法。

（1）光学显微镜检查：对组织和细胞进行石蜡包埋、切片经染色后，在光学显微镜下观察，根据细胞形态学变化特点，判断或计数凋亡细胞。

（2）电子显微镜检查：标本经固定、脱水、包埋、切片和染色等环节处理，利用透射电镜观察细胞的特征性形态学改变，可准确地判断凋亡细胞（形态学变化见椎间盘细胞凋亡的形态学特点）。电子显微镜观察是确定凋亡细胞最具权威的方法。

（3）荧光显微镜检查：体外培养的细胞悬液用吖啶橙（acridineorange）或PI（propridium iodide，PI）染色后（如在切片上进行则需先经RNA酶的作用），在荧光镜下寻找荧光细胞。荧光镜检查的最大优点是简便易行，但一般认为其定量效果较差，故很少单独使用。

（4）放射自显影检查：通过活细胞对放射性物质的特异性摄取以显示该细胞的功能状态。首先将放射性核素标记的物质注入被检者体内，间隔一定时间后取材，制作切片并涂以薄层感光乳胶，然后暗处曝光，再显影定影。经以上处理后，会在放射性核素标记部位，光镜下可观察到溴化银被还原为黑色的微细银粒，凋亡细胞显影颗粒明显减少。

另外，除根据形态变化判断细胞凋亡外，因椎间盘各部的细胞外基质中均含大量多糖，可用PAS反应，或甲苯胺蓝和番红O染色，观察基质内多糖的着色情况，根据反应强弱可间接判断细胞的功能。

2．生物化学检测

（1）DNA凝胶电泳：正常活细胞DNA电泳为一条区带，细胞凋亡时核酸内切酶将DNA分解成规则的180～200bp的DNA片段。因此凋亡细胞DNA电泳会出现特征性“阶梯状”条带。该方法将洗涤的细胞进行溶解及DNA的提取是重要步骤。DNA电泳法的缺点是不能进行准确定量。其灵敏性较差，被测标本细胞数在106个以上才能使电泳清晰。

（2）原位末端标记：原位末端标记（in situ end－labeling，ISEL）是通过末端脱氧核苷酸酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）和DNA聚合酶Ⅰ或Klenow大片段把已标记的核苷酸结合到DNA的断链处，再通过一定的显示系统显示出来。常用两种方法：①末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）；②DNA聚合酶Ⅰ或Klenow大片段介导的原位缺口平移（in situ sick translation，INST）。标记方法有核素、荧光素、地高辛或生物素等。

①ISNT，DNA多聚酶将核苷酸整合到凋亡细胞内断裂的DNA处的3′末端，同时水解5′末端，利用Klenow大片段的5′－3′聚合酶活性，将外源掺入的带有生物素标记的游离核苷酸从3′羟基末端起始5′－3′方向连接在断端上以修复DNA，这样可显示出有断裂DNA的细胞。该法同样也可以用于细胞悬液中凋亡细胞的观察。

②TUNEL原理与ISNT相似，所介导的酶是TdT，利用TdT将核苷酸从5′末端整和到双链缺损或断裂的DNA链上，以修复DNA，已标记的核苷酸则可显示出修复的片段。

这两种方法可以检测早期凋亡细胞，且特异性和敏感性都较高，就其敏感性而言，TUNEL鉴定高于INST鉴定，尤其在细胞凋亡的早期。

（3）ELISA检测：细胞凋亡时Ca2＋、Mg2＋依赖性内源性核酸酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡核苷酸小体，核小体由组蛋白及其伴随的DNA片段组成，可用酶联免疫吸附法（ELISA）检测。该法敏感性高，不需要特殊仪器，可检测5× 102/ml个凋亡细胞。

（4）Annexin－Ⅴ联合PI法：正常活细胞磷脂结合蛋白－Ⅴ（Annexin－Ⅴ）和PI均低染，凋亡细胞PI高染。文献报道，凋亡时细胞膜上磷脂酰丝氨酸外露早于DNA断裂，因此该法检测早期凋亡较TUNEL更为灵敏，且该法不需固定细胞，避免了TUNEL因固定而出现的DNA片段丢失，是目前最为理想的凋亡定量检测方法。

（5）Caspase酶学检查：在适当的温度和pH条件下，酶催化其特异性底物，形成初级反应产物，然后用捕获剂捕获该反应产物，在该酶存在的部位形成有色反应终产物，根据着色深浅，判断细胞的生命状况。

3．流式细胞仪检测　又称荧光激活细胞分类器（fluorescent activated cell sorter，FACS），通过FACS观察细胞凋亡有以下特征：①由于细胞内核酸内切酶的激活，使DNA降解，DNA特异性荧光染色减少；②细胞质膜完整；③线粒体仍有膜电位；④保留了ATP依赖的溶酶体质子泵；⑤由于细胞的内源性蛋白酶被激活，蛋白含量明显减少；⑥凋亡发生时，前散射光减少，侧散射光不变或减少。该方法具有简单、快速等优点，而且可在细胞分类的基础上，再作进一步的形态和生化分析。