肝细胞移植术护理

20世纪初许多学者提出了移植健康的细胞或脏器碎片来治疗严重的肝及代谢性疾病的设想，但细胞移植的发展一直与原位器官移植及相应学科相形见绌。直到理论上证实移植分离的细胞具有许多优点，细胞移植的研究才获得新的进展。

早在20世纪30年代Cameron和Oakley已开始了肝碎片移植的基础实验。科学家们试图异位移植肝碎片，但大多数病例肝组织在数日或数周内即退化或消失。

肝细胞移植的实质性进展是在发展了分离肝细胞的方法之后，通过原位灌注胶原酶，成功地获得了大量高度纯化的肝细胞。而在同一时期取得的另一进展，即通过移植分离的胰岛细胞可至少部分逆转实验性糖尿病，激励了肝细胞移植在欧美的研究热潮。Groth等先后报道，门脉内输注分离的肝细胞或皮下移植肝肿瘤细胞可明显降低Gunn大鼠（高胆红素血症大鼠）的胆红素。这是第一次关于肝细胞移植成功地纠正代谢缺陷的报道。

国外20世纪90年代开始，已经将肝细胞移植应用于临床，并取得了一定的成果。1993年印度学者Habibullah等为7例急性肝功能衰竭患者行人胎肝细胞腹腔内移植，成功3例。1998年Fox等经门静脉肝细胞移植治疗1例10岁的Crigler-Najjar1型综合征患者，部分纠正了肝代谢障碍。Strom等用冻存的人肝细胞复苏后经脾动脉肝细胞移植治疗1例急性肝功能衰竭，移植目的主要是缓解病情，等待原位肝移植。国内1995年陈成伟用人胎肝细胞悬液治疗7例重型肝炎，4例存活。之后全国重症肝炎攻关组对453例确诊为急性亚急性重型肝炎进行了治疗研究，病死率明显降低。由于健康供体肝脏的严重短缺且费用昂贵，仅有少数需要肝移植患者可以接受原位移植治疗。肝细胞移植技术有可能解决不能进行肝移植肝病患者的燃眉之急，同时也更适合我国大量患者的经济承受能力。肝细胞移植治疗重症肝病，具有创伤性小、费用低廉、安全性高，免疫原性小，而且一个供体可以为多个受体提供细胞来源。经过多年的基础研究，肝细胞移植已经应用于临床，目前已有多位患者接受了同种异体肝细胞移植或自体肝细胞移植（应用或不应用基因修饰），证实肝细胞移植对于治疗肝脏遗传性疾病及各种原因引起的肝衰竭有应用价值。

【目的】肝细胞移植（hepatocellular transplantation，HCT）是将正常肝脏经过体外分离成为活的肝细胞，通过脾动脉注射途径将一定数量正常活肝细胞移植到患者的体内，移植的肝细胞在体内（脾脏和肝脏内）活化增殖及重新构建肝脏结构，达到提高肝脏功能或改善肝代谢性疾病。治疗后1个月内在患者病情许可情况下需要经皮肝组织穿刺活检及相应的实验检测，以明确移植肝细胞种植生长情况。

【原理及作用机制】供体细胞在正常肝脏内不能生存、分裂、增殖，受体肝脏发生病变时，为供体肝细胞在受体肝脏内存活提供了生长优势，供体肝细胞才能在受体肝脏内生存、分裂。经脾动脉肝细胞移植后，部分可以在脾脏内生存，形成肝小叶样结构，部分可以经脾静脉-门静脉移行入肝脏，参与病变肝脏的重建。

肝细胞移植研究供体细胞在受体内的命运，通过脾脏移植后发现：肝细胞可以在脾脏内生存，脾脏结构及细胞外基质可能在支持供体肝细胞生存并发挥肝细胞功能作用方面提供了良好的“土壤”。Mito等最先报道应用肝细胞移植治疗肝衰竭患者，供体肝脏来源于手术切除的部分肝叶，经脾脏输注，经放射性同位素检测证实9例患者中有8例脾脏内有移植的肝细胞，称之为“脾之肝化”。

经脾脏移植后大部分供体细胞经门静脉系统进入到肝脏，进入肝窦后，到达Disse间隙，与受体肝细胞形成新的肝小叶结构。动物试验中已经证实：采用急性肝损伤或肝硬化模型，大量供体细胞可以在鼠的肝脏内定居并增殖。正常肝细胞具有强大的自我复制能力，在诱导FAH突变的小鼠模型中，一个供体肝细胞可以在受体内分裂超过80次。Kvittingen等发现：遗传性酪氨酸血症1型患者，供体肝细胞在受体肝脏内表现为正常肝细胞表型，并且供体肝细胞具有干细胞样特性，通过检测肝小叶的结构，某些细胞分化了20次，这些个案表明：正常肝细胞与受体肝细胞相比有生长选择优势。

在Ohashi等做的研究中证实：在患有病毒性肝炎的患者中，移植的肝细胞更能活化增殖。通过病毒性肝炎患者与非感染患者肝细胞的端粒酶长度比较，前者比后者的肝细胞活化增殖程度平均多40倍。由于供体肝细胞具有生长选择优势，移植的肝细胞有能力在受体内增殖及重新构建肝脏结构。Rhim等报道，应用白蛋白-尿激酶转基因鼠移植同系正常肝细胞，肝脏的80%发生重建，在这个试验中，由于供体正常肝细胞的生长选择优势，破坏了表达尿激酶的受体肝细胞。Overturf等做的研究表明：在遗传性酪氨酸血症1型的老鼠模型，移植的肝细胞有很强的活化增殖能力，移植的肝细胞大约占肝细胞总量的1%，在8周时间内这些细胞重建了整个肝脏的80%，将已经发生重建的受体肝细胞移植到另外的遗传性酪氨酸血症1型的老鼠模型体内，证实移植的肝细胞可以活化增殖69次。

【用物准备】

1.高压物品　250ml及100ml玻璃瓶、15cm培养皿、负压滤器、滤膜、250ml烧杯、纱布。

2.灌注液配置　磁力搅拌后，调整pH，负压过滤除菌，4℃保存。

（1）灌注液1：无钙、镁离子，含有羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、乙二胺四乙酸（EDTA）。

（2）灌注液2：含有钙、镁离子，0.05%Ⅳ型胶原酶。

3.其他　备好心电监护仪、中心吸氧装置、吸引装置、止血、升压药物等。

【操作方法】

1.胎肝细胞的分离

（1）术前紫外线消毒细胞分离室1h，消毒手术器械，紫外线消毒超净台，37℃水浴灌注液。

（2）消毒供体腹部皮肤，铺无菌洞巾。

（3）进入腹腔后，脐静脉插管，切除肝脏，将肝脏移入超净台无菌培养皿内。

（4）经脐静脉插管灌注灌注液1，流速20ml/min，10min左右，肝脏稍变白后停止灌注。

（5）将肝脏放入另一培养皿，灌注灌注液2，流速20ml/min，10min左右，肝脏变软后停止（灌注时保持肝包膜完整），钝性去除肝包膜，钝性分离肝组织，去除结缔组织。

（6）将肝细胞放入250ml烧杯内，烧杯口用双层无菌锡纸覆盖37℃水浴5～10min，间歇振荡烧杯。

（7）将消化后的肝细胞经双层无菌纱布过滤，置另1个250ml烧杯中，加入等体积4℃1640基培。

（8）将上述细胞悬液置于50ml离心管内，4℃，50g，3min，洗涤细胞3次。

（9）将已经洗涤的肝细胞放入生理盐水中，调整细胞密度为（1～2）×106，放入100ml无菌玻璃瓶中，准备临床应用。

2.胎肝细胞的冻存

（1）若冻存胎肝细胞，上述洗涤肝细胞后，应用人AB血清重悬细胞，计数及活力，调整细胞数为1×107/ml。

（2）配置冻存液，60%1640基培，40%二甲亚砜（应用前15min配置）。

（3）肝细胞悬液与冻存液比例为3∶1，放入5ml冻存管内，4℃冻存1h，-20℃冻存1h、-80℃冻存2h，最后置于液氮罐内保存。

3.胎肝细胞的复苏

（1）从液氮罐内取出冻存细胞，迅速置于37℃水浴箱内1～2min迅速融解。

（2）4℃1640基培与复苏细胞悬液按照3∶1加入到50ml离心管中，50g，3min，洗涤3次。最后将肝细胞重悬于生理盐水中，计数及活力，调整细胞密度为（1～2）×106（见肝细胞分离、冻存与复苏标准操作程序），治疗前提前2h复苏细胞，细胞数量（1～5）×108，洗脱后用100ml生理盐水或PBS液重悬细胞后，分2瓶分装于100ml生理盐水瓶中，无菌密封并37℃保温瓶水浴中运送，期间应间断缓慢震动细胞瓶。

4.肝细胞移植操作

（1）在介入治疗室进行介入操作。

（2）股动脉插管至脾动脉、肝动脉。

（3）注射细胞前肌内注射异丙嗪25mg。

（4）导管致所需位置后用20ml注射器分次快速注射入导管。

（5）治疗结束压迫股动脉穿刺部位30min，并沙袋加压。

（6）介入造影资料刻录入CD盘。

【适应证】肝细胞移植适用于各种急、慢性重型病毒性肝炎、肝硬化失代偿期、肝脏代谢性疾病等。具体包括：

1.年龄≥18岁和≤50岁。

2.乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）阳性，抗-HBs阴性至少6个月。

3.失代偿性肝病（Child-Pugh评分＞5分），出现下列情况其中一种为Child-Pugh评分＞5分，即血清清蛋白＜35g/L；凝血酶原时间（PT）延长≥4s；血清胆红素＞34μmol/L；既往出现过肝性脑病、静脉曲张破裂出血、腹腔积液。

【禁忌证】

1.严重的精神病史、癫病史，尤其是抑郁症，或目前服用抗惊厥药物。

2.伴有功能障碍的慢性肺病。

3.严重的心脏疾病（NYHA功能Ⅲ级或Ⅳ级，6个月内出现的心脏功能不全，室性快速心律失常需要进行治疗，不稳定型心绞痛或其他明显的心血管疾病）。

4.主要器官移植或者发现严重疾病，恶性肿瘤的证据。

5.术前1年内吸毒或者接受美沙酮治疗者。

【优点】HCT可用于治疗遗传性肝脏疾病，作为肝移植的替代疗法可用于治疗急性、亚急性、慢性肝衰竭，并可克服肝移植费用昂贵、技术复杂，供体肝严重短缺、手术死亡率相对较高等困难。HCT在各类动物模型中被广泛运用以研究其用于人类的安全性和疗效。动物实验证明，肝细胞移植可改善急性肝衰竭和先天性代谢性肝病动物的肝功能和预后。

【护理】

1.术前准备

（1）受体的准备

①心理护理：患者往往因为不了解手术过程而产生恐惧和焦虑情绪，护士应及时对其做好心理疏导，耐心向患者介绍手术环境、手术过程、手术医生、术后注意事项及术后可能出现的不良反应等，减轻患者的心理压力，使之积极配合治疗。

②检测患者的肝功能、甲胎蛋白、血常规、乙型肝炎病毒-DNA定量、血肌酐、尿素氮、血糖、凝血及凝原时间、出凝血时间、血型等生化指标，行腹部B超、心电图、胸部X线片、肝穿刺等检查。

③做好皮肤清洁，手术区域皮肤给予（双侧腹股沟区）备皮。

④签署知情同意书。

⑤准备单间病房，病房终末消毒1次，病房内备心电监护仪、急救药品和急救器材。

（2）供体的准备：供受体进行血型交叉配型，常规筛查乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒抗体、艾滋病抗体。应用外科技术获得肝细胞，经过分离、培养、冻存，用5%葡萄糖注射液100ml重悬肝细胞并置于生理盐水瓶（已高压灭菌），细胞密度为2×106/ml，内加地塞米松2mg，准备临床应用。

（3）术前给予清淡饮食，减少脂肪摄入，以减轻肝脏负担，手术当天晨禁食。

（4）术前留置静脉导管，术前30min开始为患者应用甲泼尼龙（甲基强的松龙）240mg置于生理盐水250ml中静脉滴注。

（5）由2名护士和经治医生携带病历资料用平推车送患者至介入操作间。

2.术中护理

（1）生命体征监测：持续心电监护，严密观察患者的体温、脉搏、呼吸、血压、血氧饱和度、神志以及意识情况，并做好详细记录。

（2）输注肝细胞：为了使移植进入体内的肝细胞发挥生物学特性，已经证实供体肝细胞需要经肝门静脉属支进入肝脏的微环境中，许多试验都是将肝细胞通过肝门静脉或经脾脏输注肝细胞，如在局部麻醉下插管经脾动脉、肝门静脉或外周静脉输注，首次应用应选择经股动脉插管脾动脉输注同种异体肝细胞。

（3）输注的细胞数量：一般输注2×108个胎肝细胞，将细胞重悬于2袋45ml Ringer乳酸盐液中，分装2瓶，分2次输注，每次输注时间为2min。

（4）脾动脉压力检测：在2次输注间隔检测脾动脉压力。

（5）腹部B超：实时监测，观察脾动脉血流速度变化情况。

3.术后护理

（1）术后24h持续监测心电、呼吸、血压、血氧饱和度、意识状态以及尿量情况，术后48h内每2小时监测并记录1次，至病情平稳。

（2）术后1周内隔天检测1次血常规、肝功能、肾功能等，1周后每周检查1次，直到结果接近正常水平，术后1年内每个月检查1次。

（3）术后1个月应对患者进行肝穿刺活检，活检标本进行定性、定量检测受体内供体细胞。

【并发症的预防及护理】经肝门静脉系统肝细胞移植的最主要并发症是肝门静脉血栓形成，最终将导致肝衰竭，严重的肝门静脉高压、出血、移植细胞进入肺脏引起肺部血栓。临床试验已经证实，经肝门静脉肝细胞移植中会短暂出现肝门静脉高压和（或）肺脏功能紊乱。

1.出血　出血主要是股动脉插管处出血，术中出现出血现象应立即停止手术，局部压迫止血，必要时输入同型血液，静脉输入血小板、凝血酶原复合物。对于有明显凝血功能障碍者，术前、术后应继续短期使用凝血酶原复合物、血小板预防。术后在股动脉插管处常规压迫止血。

2.感染　可能在细胞分离过程中及侵入性操作引起感染。在分离细胞及手术操作过程中严格执行无菌操作，术前、术后短期应用抗生素，监测体温变化。

3.脾动脉血流动力学改变　文献报道1例OTC患者，经肝门静脉输注109个细胞，肝门静脉压力升高将近70%，可能与输注过程过快导致脾动脉压力升高。

处理：输注期间检测脾动脉压力，根据压力变化再决定是否继续输注，或者延长输注时间。若效果不佳，停止肝细胞输注，并进行观察。

4.脾栓塞　主要由于输注较大的细胞团块可能引起部分脾栓塞。

处理：肝细胞分离时经过100目滤网过滤后去除大的细胞团块，输注过程中定时振荡，防止细胞形成团块。若出现术后左上腹剧痛，可以使用非甾体类止痛药物治疗。

5.排异反应　在胎肝细胞移植中，由于1个胎肝中含1%～2%成熟T细胞，因而一般不会发生宿主抗移植物反应。对于成体肝细胞移植，排异反应发生的快慢和严重程度取决于供受体组织相容性的匹配程度。

处理：输注过程中给予甲泼尼龙（甲基强的松龙）1g/d，移植后5d内从200mg/d递减到20mg/d；之后口服泼尼松（强的松），6个月内从20mg/d递减到2.5mg/d。口服他克莫司，维持血药浓度在10～15ng/ml。

6.肺栓塞　一般与输注途径相关，Bilir等报道，经颈静脉途径输注肝细胞，移植后X线胸片发现肺脏出现阴影，患者死亡后尸检发现肺内有移植的肝细胞。而经脾脏或肝门静脉途径没有出现肺栓塞的报道。

处理：如果出现肺栓塞，按照急性肺栓塞行溶栓治疗，可以应用尿激酶（UK）20000U/kg加入250ml液体中静脉输注2h；或者rt-PA10mg加入10ml液体中10min内静脉注射，然后rt-PA40～90mg加入90ml液体中110min内静脉输注。

7.不可预知的其他不良反应（麻醉意外）　采用利多卡因局部麻醉，由于用药量少，产生麻醉意外可能性较小。

处理：常规应用剂量，操作过程中进行心电监护，床边配备急救药物。

【健康教育】

1.指导患者保持良好心情，养成良好的日常生活习惯，注意休息、适当体育锻炼。

2.患者宜进清淡、易消化的饮食，忌油炸、辛辣、坚硬的饮食，禁酒。

3.服用免疫抑制剂的患者要避免感冒及其他感染。

4.嘱患者定期到医院随访，监测肝功能、凝血功能等。

（杨淑玲）