及血型鉴定

1．检验目的

检测红细胞表面ABO血型抗原、RhD抗原及血清（或血浆）中抗A、抗B抗体，确定受检者ABO及RhD血型。

2．检验原理

2.1 手工试管法、玻片法或纸板法　利用标准IgM抗A/B血清鉴定红细胞表面ABO抗原即正定型，利用已知ABO血型反定红细胞鉴定同一标本血清（或血浆）中的抗A/B抗体即反定型，综合正反定型结果确定受检标本ABO血型；利用标准IgM抗D直接鉴定RhD血型。

2.2 微柱凝胶法　ABO/RhD卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶颗粒中，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。

2.3 玻璃珠微柱法　ABO/RhD卡的微管中装填有玻璃微珠和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，玻璃微珠具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过玻璃微珠，使其悬浮在玻璃微珠层的上端，未凝集的红细胞则可以通过玻璃微珠之间的微小空隙到达微管底部。

3．适用范围

适用于手工、半自动、全自动ABO血型及RhD血型鉴定试验。

4．设备性能参数

各种血型检测系统性能指标参见相应血型检测系统说明书。

5．器材与试剂

5.1 器材：WADiana全自动血型配血系统、SWING-SAXO血型配血系统、Techno全自动血型配血系统、强生Othro Autovue Innova全自动血型及配血系统、B 600-A型低速离心机、KA-2200血清学专用离心机、阅片灯箱、塑料软试管、塑料硬质试管（100 mm×12 mm和75 mm×12 mm）、血型鉴定专用纸板、玻片、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。

5.2 试剂：Diana DG Gel ABO-CDE血型卡、DiaMed ABO/RhD血型卡、Othro Biovue ABO/RhD血型卡、2%氢氧化钠溶液、生理盐水、抗A/B标准血清、抗D标准血清、3%～5%反定试剂红细胞、1%反定试剂红细胞。

6．标本要求

EDTA-K3或EDTA-K2抗凝静脉血≥3 ml经B 600-A型离心机1 760 r/min离心5 min，离心后无溶血及明显乳糜。紧急情况下可以使用抗凝动脉血。

7．校准步骤

各类血型配血系统的校准操作过程分别见《WADiana全自动血型配血系统标准操作程序》、《SWING-SAXO血型配血系统标准操作程序》、《Techno全自动血型配血系统标准操作程序》、《强生Othro Autovue Innova全自动血型及配血系统标准操作程序》。

8．操作步骤

8.1 试管法

8.1.1 ABO血型正定型试验

8.1.1.1 取两支洁净试管，做好标记，按试管标记向试管中加入抗-A、抗-B血清各1滴；

8.1.1.2 向每管中各加入1滴3%～5%被检红细胞盐水（血清或血浆）悬液；

8.1.1.3 轻轻混合试管内容物，经KA-2200离心机1 000 r/min离心15 s；

8.1.1.4 结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；

8.1.1.5 记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。用ABO反定型试验进一步验证正定型结果。

8.1.2 ABO血型反定型试验

8.1.2.1 取两支洁净试管，做好标记，向每管中各加2滴被检血清（或血浆）；

8.1.2.2 按试管标记向试管中加入3%～5%A型、B型试剂红细胞各1滴；

8.1.2.3 轻轻混合试管内容物，经KA-2200离心机1 000 r/min离心15 s；

8.1.2.4 结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；

8.1.2.5 记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。与正定型结果进行相互验证；

8.1.2.6 如果反应较弱，可将试管于室温（或4℃）放置5～10 min，以促进弱抗体的反应，再离心观察结果。如果反应还是很弱可以增加血清（或血浆）滴数，最多到6滴以加强反应。

8.1.3 RhD血型鉴定试验

8.1.3.1 取一支洁净试管，做好标记，加入抗-D血清1滴；

8.1.3.2 向试管中加入1滴3%～5%被检红细胞盐水（血清或血浆）悬液；

8.1.3.3 轻轻混合试管内容物，经KA-2200离心机1 000 r/min离心15 s；

8.1.3.4 结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；

8.1.3.5 记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。

8.2 玻片法

8.2.1 ABO血型正定型

8.2.1.1 在标记的玻片上分别加1滴抗-A、抗-B标准血清，再各加1滴红细胞悬液（按试剂说明书的要求配制受检者红细胞浓度）；

8.2.1.2 用干净的玻璃棒将红细胞悬液和试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖大约20 mm×20 mm的面积；

8.2.1.3 缓慢连续倾斜转动玻片2 min，观察结果并记录。不要把玻片放在加热的表面物上，以防水分蒸发。

8.2.1.4 结果判断

8.2.1.4.1 凝集或发生溶血为阳性结果；

8.2.1.4.2 细胞混匀2 min后仍呈悬液状态的为阴性结果；

8.2.1.4.3 对结果有怀疑，应用试管法重复实验。

8.2.1.5 注意事项

8.2.1.5.1 玻片试验不适用于ABO反定型试验。

8.2.1.5.2 不要混淆玻片边缘干燥的红细胞与真凝集。

8.2.2 RhD抗原定型试验

8.2.2.1 在一块标记的干净玻片上加1滴IgM或（IgM+IgG）抗D标准血清；

8.2.2.2 在第二块标记的玻片上加1滴合适的对照试剂；

8.2.2.3 在每块玻片上加2滴受检者40%～50%红细胞悬液；

8.2.2.4 用玻棒将细胞悬液试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖玻片20 mm×20 mm面积；

8.2.2.5 把两块玻片同时放在观察箱上，缓慢连续倾斜转动并观察凝集。多数试剂要求试验必须在2 min内判读结果。

8.2.2.6 结果判断

8.2.2.6.1 当含有抗D血清的玻片上出现红细胞凝集而对照玻片上是均匀红细胞悬液时为阳性结果；

8.2.2.6.2 当含有抗D试剂的玻片和对照玻片上都是均匀的细胞悬液时，提示是阴性结果，如果要进行RhD阴性确认试验，可参照《RhD血型确证试验（卡式抗人球法）标准操作规程》；

8.2.2.6.3 如对照玻片上出现凝集，在未经进一步试验之前，不能解释为阳性结果；

8.2.2.6.4 玻片边缘附近的干涸不应该混淆为凝集。

8.3 纸板法（ABO血型正、反定型及RhD定型同时鉴定）

8.3.1 取洁净五孔血型鉴定专用纸板，做好姓名标记；

8.3.2 按纸板标识向每孔中分别加入相应试剂抗A、抗B、抗D血清各1滴以及受检者血清各2滴；

8.3.3 各孔中分别加入受检者红细胞适量及相应所需3%～5%A型、B型试剂红细胞（自制或商品化试剂）并搅匀；

8.3.4 轻轻旋转摇晃混匀，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块，边摇边观察；

8.3.5 3 min以上观察结果。记录观察到的凝集程度或溶血程度。

8.4 制备反定红细胞的操作步骤

8.4.1 分别取3～5人份已知A、B血型的红细胞，同型混合后用生理盐水洗涤、离心（前两次1 760 r/min，3 min，第三次1 760 r/min，5 min）3次，去上清制备成压积红细胞；

8.4.2 用生理盐水配成浓度为5%的试剂红细胞：9.5 ml生理盐水加0.5 ml压积红细胞；

8.4.3 配制好的红细胞悬液应使用抗A、抗B标准血清进行血型鉴定，A细胞与抗A、B细胞与抗B均应出现(＋＋＋＋)强度的凝集；

8.4.4 保存条件：配制好的5%的红细胞悬液在试管上注明红细胞血型及配制时间，2～8℃避光保存，有效期24 h；

8.4.5 将用于制备反定红细胞的供者信息及血型复核结果记录在《反定试剂红细胞制备登记表》上。

8.5 WADiana全自动ABO及RhD血型鉴定

参照《WADiana全自动血型配血系统标准操作程序》进行。

8.6 SWING-SAXO系统ABO及RhD血型鉴定

参照《SWING-SAXO血型配血系统标准操作程序》进行。

8.7 Techno全自动血型/配血系统ABO及RhD血型鉴定

参照《Techno全自动血型配血系统标准操作程序》进行。

8.8 Othro Autovue Innova全自动ABO及RhD血型鉴定

参照《强生Othro Autovue Innova全自动血型配血系统标准操作程序》进行。

8.9 检验结果的输入与确认

8.9.1 启动“检验程序”，输入用户名及口令后，进入检验程序。

8.9.2 自动传输结果的输入　单击“检验”菜单，选择“检验结果录入\修改”，进行检验结果的录入及修改。输入工作单号仪器会自动传输检测结果。

8.9.3 非传输结果及镜检结果的输入　单击“检验”菜单，选择“检验结果录入\修改”，通过申请序号进行检验结果的录入及修改。

8.9.4 检验结果的确认　检验结果应由实验室负责人或授权人员进行确认，方法为单击“结果处理”菜单，选择“报告确认”进入结果确认，通过选择“工作单元”、“报告日期”、“单张”或“批量”后，按“提取”键提取已经传输或录入的检验结果，经两人核对无误后按“确认”键进行确认。

9．质量控制

9.1 室内质量控制

9.1.1 手工试管法、玻片法或纸板法：每日（或当日更换试剂包装时）进行试剂质控，具体操作参照《输血相容性检测室内质量控制管理程序》进行。

9.1.2 全自动卡式：每日（或当日更换试剂批号时）进行过程质控，具体操作参照《输血相容性检测室内质量控制管理程序》进行。

9.2 室间质量评价

参加卫生部临检中心组织的全国输血相容性检测室间质量评价活动。

10．干扰因素

10.1 严重的黄疸或脂血使全自动血型检测系统出现反定型假阳性；

10.2 冷凝集素或异常球蛋白增高会使红细胞出现异常凝集，从而影响正定型或（和）反定型结果，出现假阳性结果；

10.3 受检者使用羟乙基淀粉、右旋糖苷等药物时可能会使细胞出现假凝集，干扰正反定型结果。

11．结果计算及测量不确定度

不适用。

12．生物参考区间

12.1 ABO血型鉴定　A、B、O、AB血型。

12.2 RhD血型鉴定　阴性或阳性。

13．检验结果可报告区间

13.1 ABO血型鉴定　A、B、O、AB血型。

13.2 RhD血型鉴定　阴性或阳性。

14．警告/危急值

受检者出现亚型或因产生不规则抗体干扰血型鉴定可能影响常规输血时，应及时通知临床医生，必要时通知患者或家属。

15．实验室解释

出现亚型结果时应遵守相应的输血原则。

16．安全性预警措施

16.1 实验室及工作人员一般安全防护措施参见《实验室安全与卫生管理程序》。

16.2 发生血液标本溢出时，应参照《实验室消毒与清洁程序》对污染的环境进行消毒处理。

16.3 操作人员发生职业暴露时，应参照《实验室职业暴露预防与处理程序》及时进行相应处理。

16.4 在仪器运转过程中，勿触及样品针、移动的传输装置等，避免造成人身伤害。禁止触摸仪器密封面板内的电路，防止造成电击损伤。

16.5 对突发传染性疾病的血液标本应启动特殊的安全防护程序。

17．变异潜在来源

17.1 出生6个月以内新生儿，体内可能尚无ABO血型抗体产生，血型以正定型为准；

17.2 老年患者、急性白血病患者、肿瘤患者可能出现血型抗原减弱而影响正定型结果；

17.3 ABO亚型会影响正常结果的判读,出现正定型减弱或出现假阴性,导致正反定型不一致。

18．ABO及RhD血型鉴定试验特别注意事项

18.1 正反定型不一致的标本一律使用试管法重复试验；18.2 正定弱于（＋＋＋），一律用试管法重复试验，并根据情况加做其他试验；18.3 玻片法、纸板法试验要注意结果观察时间，既不能过短，因反应不充分出现假阴性，也不能过长（一般不超过5 min），因水分蒸发造成红细胞假凝集；

18.4 实验室自制试剂红细胞需经标准血清正定型鉴定无误后方可使用；

18.5 试剂红细胞需将3个以上健康供者同型新鲜红细胞混合，用生理盐水充分洗涤3次，以除去存在于血清中的抗体、蛋白成分及可溶性抗原；

18.6 所有全自动方法的注意事项分别参照各检测系统的标准操作规程。

19．报告时间

ABO及RhD血型鉴定于当日下午17点前出结果并上传HIS系统。

20．参考文献

[1] WADiana全自动血型配血系统、SWING-SAXO血型配血系统、Techno全自动血型配血系统、Othro Autovue Innova全自动血型及配血系统、抗A/B标准血清、抗D标准血清、反定试剂红细胞使用说明书．

[2] 临床输血技术规范．中华人民共和国卫生部医政司．北京，2000．

[3] 中国输血技术操作规程（血站部分）．．中华人民共和国卫生部医政司．天津，

1997．