真菌耐药性

一、真菌耐药性的概念

真菌耐药性指的是通过体外测定，与同一种内的其他真菌相比，某真菌对一种或几种抗真菌药物不敏感。需要强调的是，临床抗真菌药物治疗失败的原因有很多，耐药只是治疗失败的原因之一；除此之外，治疗失败的原因还包括患者的免疫状态差、药物的生物利用度低、药物代谢速度快等。

二、真菌耐药性的流行病学

部分真菌对某些抗真菌药物天然耐药，如克柔念珠菌、光滑念珠菌、多数丝状真菌对氟康唑天然耐药，土曲霉对两性霉素B天然耐药，接合菌对多数抗真菌药物天然耐药。还有一部分真菌耐药是获得性的，即该类真菌对抗真菌药物天然敏感，由于与某药物接触（治疗或体外诱导）而导致对其不敏感。随着抗真菌药物的广泛应用，分离到的耐药白念珠菌增多，尤以对唑类药物耐药最为突出。烟曲霉对唑类药物的获得性耐药报道也在增多。本节总结了真菌耐药性的流行病学及耐药机制，重点阐述白念珠菌和烟曲霉这两种在耐药机制方面研究较为深入的真菌。

三、唑类药物

（一）流行病学

白念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌对唑类药物敏感；获得性耐药主要发生在长期使用氟康唑的HIV／AIDS的口咽念珠菌病患者。部分光滑念珠菌对氟康唑天然耐药，克柔念珠菌对氟康唑天然耐药。隐球菌对唑类药物耐药少见。除皮肤癣菌外，丝状真菌对氟康唑天然不敏感。对唑类耐药的烟曲霉虽然不是很多，但近年来报道逐渐增多。接合菌对多数唑类药物不敏感，但新型三唑类药物泊沙康唑有一定的抗接合菌活性。

（二）耐药机制

唑类抗真菌药物通过抑制14α脱甲基酶，使麦角固醇合成受阻，导致真菌细胞膜的完整性受损，发挥其抗真菌作用。真菌对唑类药物的耐药机制主要包括其作用靶酶编码基因ERG11基因突变和过度表达，外排泵编码基因CDR1、CDR2、MDR1基因过度表达。

1．靶酶编码基因突变　唑类药物靶酶Cyp51编码基因ERG11突变是真菌对该类药物产生获得性耐药的主要机制之一。突变后的基因产物与药物的亲和力下降。而那些对唑类药物天然不敏感的真菌的Cyp51酶与唑类药物的亲和力本身就是低的，所以天然耐药。

White等对从同一HIV感染者口咽部分离得到的匹配株（matched　sets　of　isolates）白念珠菌的研究发现，与敏感株相比，耐药株14α脱甲基酶发生R467K突变。单一的R467K突变足以引起白念珠菌对氟康唑耐药。另外，14α脱甲基酶上的F126L、G129A、T229A、Y132H、G307S、S405F、F449S、G464S、I471T突变均能导致白念珠菌对氟康唑耐药。

临床分离株白念珠菌的两个等位基因常为杂合子。在氟康唑敏感株白念珠菌，ERG11基因编码区、启动子区、终止区及其下游的THR1基因均为杂合子；当发展成为氟康唑耐药株后，不但两条染色体上的ERG11等位基因发生R467K突变，而且上述杂合现象也同时消失。这种染色体改变是由于染色体结构发生改变所引起的。

烟曲霉有2个Cyp51酶同源基因（CYP51A和CYP51B）。依据基因序列推出的Cyp51A和Cyp51B蛋白与其他真菌的Cyp51蛋白高度同源。

CYP51A基因突变能导致烟曲霉对伊曲康唑和（或）泊沙康唑耐药，其中Cyp51蛋白的54、220位点为突变热点，有多个研究报道了这两个突变和耐药有关。Diaz－Guera等分析了从临床分离到的12株伊曲康唑耐药、3株伊曲康唑敏感的烟曲霉的CYP51A、CYP51B基因。其中6株伊曲康唑耐药株烟曲霉CYP51A基因的54位的G被其他氨基酸替代，而54位点恰位于Cyp51A蛋白的高度保守区域，这说明可能是保守区域的突变影响了药物和靶酶的相互作用，从而引起耐药。通过基因转化的方法用伊曲康唑耐药株曲霉CYP51A基因（带有G54R突变）来替换野生敏感株菌后，转化子均表现出对伊曲康唑耐药。另外一个突变热点在220位点氨基酸上，耐药株与敏感株相比，CYP51A基因发生了Met220突变，该位点氨基酸被Val、Lys或Thr替代。同样，当把有突变的CYP51A基因导入到敏感的野生株后，转化子表现出对伊曲康唑、伏立康唑、雷夫康唑、泊沙康唑的敏感性均下降，这些均说明该突变与耐药表型有关。

2．靶酶表达水平升高　唑类药物作用靶酶过表达是光滑念珠菌对唑类药物耐药的机制之一。白念珠菌ERG11表达在唑类耐药虽然起一定作用，但并不是最重要的。转录因子Upc2p能够上调ERG11基因的表达。野生型、UPC2／upc2以及重构的白念珠菌UPC2株在氟康唑存在的环境下生长时，其ERG11、ERE2基因表达上调；相反，白念珠菌Δucp2株在此种环境中生长时，上述两基因表达并无上调，且对唑类药物敏感。此外，组蛋白乙酰化／去乙酰化状态也与白念珠菌ERG11基因的表达水平相关。组蛋白去乙酰化酶抑制药能抑制唑类药物诱导的ERG11基因表达水平升高。

烟曲霉伊曲康唑敏感株在获得额外拷贝的PDMA基因（构巢曲霉的麦角固醇合成酶基因）后，对伊曲康唑的耐药性增高，因此推测烟曲霉对伊曲康唑耐药可能是Cyp51酶过度表达或其基因扩增引起。但目前为止仍没有直接的证据证明CYP51A、CYP51B基因的表达水平在敏感株和耐药株间有明显差异。

3．固醇合成途径中非ERG11基因的改变　唑类药物抑制14α脱甲基酶后不但导致麦角固醇耗尽，而且还能引起甲基化的固醇14α－methylergosta－8，24（28）－dien－3β，6α－diol蓄积，后者抑制白念珠菌生长。在唑类药物存在的情况下，固醇合成途径的改变能减少上述固醇的蓄积，出现对唑类药物耐药。例如，ERG3基因突变后则不能生成有活性的△5，6去饱和酶，于是引起真菌细胞内蓄积的固醇中间产物转变为14α－甲基法尼醇（14α－methylfecosterol），而不是methylergosta8，24（28）dien3，6αdiol，前者能够部分地代替麦角固醇的功能，支持真菌生存。ERG3基因敲除的白念珠菌突变子对氟康唑敏感性明显降低。然而，在烟曲霉中，ERG3基因敲除或增加ERG3基因的拷贝数均不影响其对唑类药物的敏感性。

与从同一患者分离出的敏感株相比，伊曲康唑耐药株烟曲霉AF72的麦角固醇含量减少，固醇中间产物增加。相反，从另一患者分离到的耐药株AF90、AF91的麦角固醇轻度增高，固醇中间产物下降。相反地，Dannaoui等用气相色谱法测定了4株伊曲康唑耐药烟曲霉固醇成分，并与4株敏感株的相比较。所有菌株的主要固醇成分均为麦角固醇。敏感株和耐药株固醇成分在质和量上均相似。结果提示在他们研究使用的菌株，伊曲康唑耐药的发生与麦角固醇合成途径改变无关。

4．外排泵过度表达　有两类外排泵的过度表达与真菌耐药有关，一类是ATP结合盒转运子（ATP　binding　cassette　transporters，ABCT），它们依赖ATP进行主动运输。另一类属主要易化子（major　facilitators，MF）超家族，通过电化学势能进行被动转运。在唑类耐药的菌株，这两类外排泵过度表达。

耐药白念珠菌的CDR1基因表达水平较敏感株高。将白念珠菌CDR1基因转化到Δpdr5酿酒酵母后，转化子对各种唑类药物的敏感性均下降。基因定点诱变发现，Δcdr1株白念珠菌对唑类药物的敏感性明显增高。

CDR2基因的表达上调也与白念珠菌对唑类药物耐药有密切关系。白念珠菌Δcdr2株对唑类药物的敏感性并不增高，但Δcdr1株比Δcdr2株对唑类药物明显敏感。临床耐药株CDR2基因过度表达者，几乎总同时伴有CDR1基因过度表达。

白念珠菌唑类药物敏感株低水平表达MDR1基因，而在唑类耐药株则持续性高表达；敲除或定点突变白念珠菌MDR1基因过度表达株的该基因后，突变子变得对唑类药物的敏感性增加。以上说明MDR1基因过表达能引起白念珠菌对唑类药物耐药。

大多数伊曲康唑高度耐药的烟曲霉突变子外排泵编码基因AfuMDR3、AfuMDR4的组成性高表达，或在暴露于伊曲康唑时诱导性高表达。实验结果提示，这两个基因之一或全部高表达与高水平伊曲康唑耐药有关。另外的实验发现，在伊曲康唑的诱导下，烟曲霉从敏感株演变成耐药株后，部分菌株的AfuMDR3、AfuMDR4组成性或诱导性高表达。

CaNdt80p通过调节CDR1基因的表达参与白念珠菌耐药。Chen等以lacZ作为报告基因在酿酒酵母内检测CaNdt80p对CDR1基因的表达调节。CaNDT80的过度表达能增加β－半乳糖苷酶的活性。相反，CaNDT80的突变能使抗真菌药物诱导的CDR1基因过度表达消失；另外，与野生株相比，ΔCandt80株白念珠菌对各种唑类药物更敏感。

TAC1（transcriptional　activator　of　CDR　genes）基因是位于MTL座位（mating　type－like locus）附近的一个基因。Tac1p有Zn（2）－Cys（6）fingers结构，在理论上，该结构会与CDR1、CDR2基因启动子区的5＇－CGG－3＇三次重复结构结合。研究发现，TAC1基因有野生型和高活性型两种等位基因。在白念珠菌暴露于诱导药的环境中（如唑类抗真菌药物），野生型TAC1等位基因介导CDR1、CDR2基因的上调。而高活性型则引起CDR1、CDR2基因持续性高表达。Coste等研究两组匹配的白念珠菌唑类敏感和耐药株TAC1基因时发现，敏感株的TAC1基因均为野生型，而耐药株的则为高活性型纯合子或高活性型／野生型的杂合子。测序发现，从唑类敏感株变成耐药株后，Tacp1发生了N977D突变，该突变位于Tac1p的活性结构域。通过定点突变证实，N977D是引起TAC1基因高活性的重要原因。TAC1基因由敏感株的野生型变成耐药株的高活性型的机制，是部分5号染色体拷贝数增加引起的。

组蛋白去乙酰化酶也参与调节CDR1、CDR2基因表达。组蛋白去乙酰化酶抑制药能抑制唑类药物诱导的CDR1、CDR2基因的高表达。

四、多烯类药物

（一）流行病学

系统用药中，两性霉素B（AMB）是多烯类药物中最常用的。多数真菌对两性霉素B敏感。但是，克柔念珠菌和光滑念珠菌对两性霉素B敏感性偏低；土曲霉和尖端赛多孢子菌均对两性霉素B天然耐药。两性霉素B获得性耐药的真菌报道极少。

（二）耐药机制

多烯类抗真菌药物与真菌细胞膜麦角固醇形成复合体，后者形成穿膜的孔洞，所以该类药物是快速杀菌药。临床作为系统用药的主要是两性霉素B。

念珠菌临床分离株对AMB耐药者少见。在体外通过一步筛选也很难得到耐药突变子。用唑类药物抑制麦角固醇合成后，能诱导AMB耐药的白念珠菌产生。这种白念珠菌AMB耐药株与唑类药物存在交叉耐药。交叉耐药是由ERG3基因突变引起。如上所述，ERG3基因突变后，真菌细胞内14α－甲基法尼醇蓄积，支持真菌生存。而此时的真菌细胞又不能合成麦角固醇，所以AMB对之失去了抗菌活性。而敲除烟曲霉ERG3基因或增加其拷贝数，均不影响其对多烯类药物的敏感性。

固醇甲基转移酶基因（sterol　methyltransferase　gene，ERG6）编码的固醇甲基转移酶，是催化麦角固醇合成途径中特有的一个关键酶。该基因突变与光滑念珠菌对多烯类药物耐药有关。同样地，增加烟曲霉的ERG6基因拷贝数不改变其对多烯类药物的敏感性。

五、氟胞嘧啶

单独用药容易发生耐药，对氟胞嘧啶（FC）耐药的念珠菌并不少见，FC耐药也见于隐球菌。

FC是核苷类似物，能选择性地进入真菌细胞内，在真菌胞嘧啶脱氨酶的作用下转化为氟尿嘧啶，后者再在尿嘧啶核酸核糖转移酶（Fur1p）作用下最终转变成磷酸核苷氟尿嘧啶（FUMP）。FUMP参入RNA分子，破坏真菌RNA的结构和功能，从而发挥抗真菌作用。另外，FUMP还可以转化成FdTMP参入DNA分子，干扰DNA的功能。

最近的分子生物学研究确定了Fur1p突变在白念珠菌对FC耐药中的作用。大多数的白念珠菌FC耐药的临床株FUR1基因有突变。C301T突变发生在Fur1p的保守区域，在FC高度耐药株为纯合突变，在中度耐药株为杂合突变。功能缺失或缺陷的Fur1p不能有效地把FC转化成毒性的FUMP，所以出现耐药。把野生型FUR1基因转化到纯合C310T突变子后，转化子对FC变得敏感。

其他研究还提示，胞嘧啶透酶（cytosine　permease）、胞嘧啶脱氨酶（cytosine　deaminase）功能缺陷或胸苷酸合酶活性改变也可能是白念珠菌对FC耐药的机制。

六、棘白菌素类

（一）流行病学

念珠菌对棘白菌素类药物获得性不敏感的报道增多，其中包括白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌。最近出现了黄曲霉对该类药物不敏感的报道。隐球菌、接合菌细胞壁上缺少β－（1，3）－D－葡聚糖，所以对棘白菌素类药物天然不敏感。

（二）耐药机制

β－（1，3）－D－葡聚糖合成酶的编码基因为FKS1。在体外诱导出的棘白菌素敏感性降低株白念珠菌发现，其两个CaFKS1等位基因之一的保守区发生突变（Phe　641to　Asp　648）与对棘白菌素类药物敏感性降低明显相关；基因定点突变的方法也发现这一区域的突变足以引起对棘白菌素敏感性降低。CDR1、CDR2、MDR1外排泵基因与白念珠菌对棘白菌素不敏感无关。FKS1突变也是导致曲霉对棘白菌素类药物耐药的原因。

（乔建军　张　宏）