胰腺分子生物学检查

随着现代分子生物学的发展和肿瘤病因研究的不断深入，有关胰腺癌基因诊断的研究也日趋增多，使胰腺癌的诊断突破了原有的细胞水平，进入到分子生物学的阶段，为胰腺癌的早期诊断、预后判断和临床治疗提供了新的途径。

一、胰腺癌相关癌基因和抑癌基因的特征

胰腺癌的生成机制虽不明了，但与细胞核内基因的改变，尤其是抑癌基因失活和癌基因活化有着密切关系。在肿瘤恶性转化和演进过程中，虽然原癌基因K－ras基因作为显性作用基因，仅单个等位基因点突变，即可导致表型细胞改变，但是多基因的共同作用在癌变过程中仍具有重要作用。因此了解某一肿瘤的相关基因对认识肿瘤的发生和发展尤为必要。目前发现与胰腺肿瘤有关的基因包括癌基因（如K－ras、AKT2和MYB等）、抑癌基因（如P53、DDC、APC、Rb－1、C－erb B2、nm23、P16、LKB1／SKT11、MKK4和ALK4等）和基因组维持基因（如BRCA2、MSI＋／TGFBR2和MLH1等），癌基因是指以非激活状态存在于细胞或病毒中，能诱导正常细胞转化，产生一个或多个新生物特性的基因，也称原癌基因。在肿瘤形成过程中，除了有原癌基因激活外，还常常伴有一种或多种基因功能的失活或丢失，而这类基因对细胞的增殖具有负调控作用，被称为抑癌基因（或抗癌基因、肿瘤易感基因和隐性癌基因）。而基因组维持基因具有纠正DNA复制中错误的功能，当这些不配对的损伤基因失活后，DNA复制中出现的错误就不能得到修复。胰腺癌相关基因染色体和基因突变率，见表2－16。

表2－16　胰腺癌相关基因染色体位置和突变率

下面就某些胰腺癌相关基因的功能和在胰腺肿瘤中的突变特点分别加以介绍。

1．ras基因　发现于1982年，ras基因家族是人类肿瘤中最常发现有点突变的癌基因族。ras基因主要有三个突变位点：12、13和61位，其中绝大多数突变位于12位。

ras基因点突变在胰腺癌中的特点如下：①发生率在胰腺癌中最高，达75%～100%，其中90%以上含有K－ras的12位点突变，故K－ras在胰腺癌中具有高突变率；②突变只表现在导管源性肿瘤，正常组织、胰腺良性病变和胰腺内分泌肿瘤未发现K－ras点突变；③突变与胰腺癌患者的年龄、性别和预后，与肿瘤分期、分化程度和转移情均无明显关系，但突变率与肿瘤大小明显相关，大肿瘤的突变率明显高于小肿瘤；④在某些慢性胰腺炎和胰管增生性癌前病变中也可出现K－ras基因的点突变，是胰腺癌早期具有的一种表现。因此，K－ras基因的检测有助于胰腺癌的早期诊断。

2．P53基因　发现于1979年，为肿瘤抑制基因。P53蛋白具有调节细胞周期的功能，可以阻止转录细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖；并可诱导细胞的凋亡和分化。

P53基因表达的特点是：①在胰腺癌中，根据不同的检测手段，P53表达缺失率变化较大，为20%～100%；②在慢性胰腺炎和正常组织中未发现有P53基因表达的异常；③P53缺失可出现在胰腺胰管增生性病变中，故推测与胰腺肿瘤的癌前病变有关，但对胰腺癌诊断和预后判断中的价值尚待进一步研究。

3．DCC基因　是已发现的最大的抑癌基因，其功能认为和细胞与细胞，细胞与基质间相互黏附作用有关。

在胰腺癌中，DCC基因表达缺失率在原发胰腺肿瘤组织中为50%左右，胰腺癌细胞株为70%左右，而且在低分化和未分化胰腺癌细胞株中尤为多见。

4．APC基因　系1991年分离成功的一种抑癌基因，是腺瘤样结肠息肉的易感基因，APC基因的功能与G蛋白激活有关。

Horii等研究表明原发胰腺癌组织中APC基因的缺失率为40%左右，虽然单独的APC突变并不足以引起肿瘤的转化和演进，但是其突变参与K－ras、P53、DCC等多种基因共同致癌的过程，是肿瘤形成的重要原因之一。

5．nm23　发现于1988年，系一种与恶性肿瘤转移有关的基因。nm23基因的功能与调节细胞内微管系统的状态，维持信号传递系统正常运行，抑制肿瘤的转移有关。

有学者研究表明nm23基因产物的表达与胰腺癌淋巴结转移、神经周围浸润、组织分化程度和预后有关，而与年龄、性别、肿瘤大小、部位和血清CEA水平无关。其异常发生率为50%～80%。

6．P16基因　发现于1994年，系一种重要的肿瘤抑制基因，位于人类染色体9q21，有2个内含子和3个exon组成。P16可直接作用于周期蛋白依赖性激酶（cdk4）、cyclinD和P11ORB蛋白活性，抑制肿瘤增殖。与胰腺癌的发生和发展密切相关。

Naumann和Okamoto等报道表明人的胰腺肿瘤中有明显的P16基因表达缺失，而这种现象与肿瘤浸润的生物学特性有着一定关系。多数报道显示胰腺癌P16基因失活十分常见，失活率高达85%～98%。因此，有人推测P16基因失活在胰腺癌的发生和发展中可能起着“核心”作用。P16基因的另一特征是其cDNA较P53小，操作容易，抑制专一性强，有利于基因治疗和抗癌药物制备。

7．RB－1基因　RB－1基因于1986年首次得以克隆，位于染色体13q14。具有调节细胞生长分化的作用，在控制细胞周期的信息系统中起关键作用。在视网膜母细胞瘤患者中的突变率为100%，在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中有较高的基因失活发生率，而在胰腺癌细胞株癌基因检测中发现RB－1基因表达缺失为10%左右。

8．C－erbB－2基因　C－erbB－2基因定位于17号染色体长臂上，在传递细胞生长信息中起着重要作用。Hall和Friess等的研究表明20%～50%的胰腺癌细胞系可过度表达C－erbB－2癌基因，这种现象是维持胰腺癌细胞恶性表型的重要原因之一。同时C－erbB－2过度表达的慢性胰腺炎患者具有恶变可能。

9．DPC－4基因　胰腺癌的一种独特的基因突变称为胰腺癌缺失4（deleted　in　pancreatic　cancer　4，DPC－4），又称为Smad4／DPC4基因。位于18号染色体，由1　660个核苷酸组成，其中有11个外显子。这种基因与转化生长因子β的信号传导过程有关。约55%的胰腺癌患者有DPC－4基因突变发生。但是在肺癌、肝癌和肾癌等肿瘤中，也可出现DPC4缺失，通常在10%以下。

在胰腺癌的演变过程中，其癌基因和抑癌基因的激活或抑制表现是多方面的，是多种基因相互作用和相互协调的结果。随着对新的肿瘤基因的发现和认识，人们将会对胰腺癌的演变过程作出本质的揭示。另外，胰腺癌的发生和发展的过程，也是一种多因素和多基因共同作用的复杂演变过程，McCormick等对胰腺导管癌的发生和发展提出了由胰腺干细胞逐步演变成浸润性肿瘤的变化示意图（图2－4），初步展现了人们认识胰腺癌的演变思路。

图2－4　胰腺导管癌的发生和发展变化示意图

TGF：transforming　growth　factor，转化生长因子；EGFR：epidermal　growth　factor　receptor，表皮生长因子受体；FGFR：fibroblast　growth　factor　receptor，成纤维细胞生长因子受体；FGF：fibroblast　growth　factor，成纤维细胞生长因子；HGF：hepatocyte　growth　factor，肝细胞生长因子；TF：tissue　factor，组织因子

二、胰腺癌基因和抑癌基因的检测方法

目前几种主要的癌基因和抑癌基因的检测方法包括以下几种。①聚合酶链反应（PCR）：该法可以检测大量标本，灵敏度高，而所需标本量少，保存的石蜡标本也可使用，仍是检测癌基因的最常用的有效方法。在PCR基础上，采用单链构象多态分析（SSCP）或限制性片段长度多态分析（RFLP）等方法为检测K－ras、P53基因点突变提供了快速、灵敏和可靠的手段。②Southern印迹法该法通过癌基因的转染杂交技术，用放射性或非放射性物质标记后自显影，方法特异性较强。与该法相类似的其他转染杂交法还有Northern、Dot等转染法。③免疫组化染色该法是检测癌基因较常用的方法，易于检测癌基因在核内的积聚情况和对细胞内癌基因的定位。④酶联免疫吸附法只要有相应癌基因蛋白的抗体，即可用该法检测癌基因蛋白，ELISA法灵敏、简便。

三、胰腺癌基因检测标本的来源

胰腺癌基因检测标本的来源包括以下几方面。①细针穿刺检查（FNA）：国内外的研究表明在超声或CT引导下进行FNA，通过检测K－ras点突变，有助于胰腺癌的诊断。有研究证实采用FNA检查，胰腺癌K－ras突变率可达90%以上，诊断阳性率为65%，与组织细胞学检查相比较诊断符合率达56%，而K－ras检测阳性的病例，经手术确诊为胰腺癌。这种方法的优点是：快速、准确、避免病理制片及形态观察上的误差，但缺点是不能明确癌细胞类型。②内镜收集胰液检测：将内镜逆行置入胰管内吸取胰液进行癌基因（如K－ras）检测，也可提高胰腺癌的诊断率。研究表明，该法诊断阳性率与肿瘤的部位有关。其中胰头部肿瘤的阳性率可达100%，胰体尾部阳性率分别为60%和0。其优点还在于对一些胰液中脱落细胞阴性，而又存有肿瘤细胞DNA片段的病例，该法仍能明确诊断。③手术：包括术中FNA、术中活检和切除组织的癌基因检测，当胰腺活检组织较少、细胞学检测有疑问时，癌基因检测在3d内即可明确诊断，并从分子生物学的角度为临床提供可靠的诊治依据。

总之，应用FNA或内镜收集胰液检测癌基因（如K－ras基因），为胰腺癌的早期诊断和术前确诊提供了可能。同时对肿瘤组织癌基因和抑癌基因的分析，也可从肿瘤的分子水平为肿瘤患者预后的预测提供帮助。

四、基因芯片检测技术

基因芯片（Gene　chip）或称为DNA微阵列（DNA　Microarray），是指固着在固相载体上的高密度DNA微点阵，即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在玻璃或硅等载体上，称为基因芯片。目前，基因芯片已应用于基因表达谱或基因突变的分析、基因分型或重测序、遗传作图或新基因寻找，药物筛选和疾病诊断等领域的研究，按其应用主要分为以下几类。①表达谱基因芯片：主要用于基因功能研究的一种基因芯片。与传统的Northern　blot检测方法相比较，具有检测系统微型化，样品需要量小，可同时检测成千上万个基因的表达变化，揭示基因之间表达变化的相互关系，灵敏度高和基因差错率小于3%等优点。②诊断基因芯片：主要用于疾病诊断的基因芯片，目前已开发出肝癌诊断芯片和糖尿病诊断芯片等。③检测芯片：主要用于微生物和商品检疫等的检测基因芯片，如病原体检测芯片和商品检疫芯片等。对胰腺癌的基因芯片探讨已有初步的研究结果，但其临床意义尚需进一步的研究。