血管内皮细胞的分离培养和鉴定方法

大血管内皮细胞的分离培养，主要采取消化酶血管内灌注法，如脐静脉、大动脉等，在一些组织培养技术专著中有较详细介绍，相对比较容易，而微血管内皮细胞的分离培养比较困难，且有其特殊性，本文主要介绍皮肤微血管内皮细胞的分离培养。

一、内皮细胞的分离培养

（一）新生儿和胎儿皮肤微血管内皮细胞的分离培养

新生儿和胎儿皮肤微血管内皮细胞的分离常采用新生儿包皮或流产胎儿的皮肤，而新生儿包皮可分为内板和外板，内板皮肤较薄，组织疏松，血管丰富，是分离真皮微血管内皮细胞最理想的材料。

1．主要材料和试剂　①标本保存液（0．15mol／L NaCl、400U／ml青霉素、200μg／ml链霉素）；②消化液（0．3%胰蛋白酶、1% EDTA的PBS、pH 7．3）；③等渗盐溶液（每升含1g葡萄糖、8gNaCl、0．4gKCl）；④DHanks溶液；⑤分离酶消化液（25U／ml）；⑥含1 000U／ml青霉素、0．5μg／ml链霉素、0．5μg／ml两性霉素B的内皮细胞培养基；⑦弯盘、组织镊等器材。

2．分离步骤　①最好采用新鲜标本，除去皮下脂肪组织，先将标本置于D－HanKs溶液中去除过多的血液及碘酒、乙醇，也可置于保存液中，4℃保存，24h内使用。如果有污染可能，可先将标本置于含抗生素的培养基中消毒4h。②将包皮内板剪成5mm× 5mm小块，直接置于消化液中，37℃消化45min。或在分离酶（dispase）消化液中，12℃消化12～18h。或直接用0．5%胰蛋白酶消化过夜。注意，蛋白酶消化法是目前分离内皮细胞常用的方法，但要说明的是，这些蛋白酶都可能使内皮细胞丢失某些特异性标志，已有人在分离肺组织微血管内皮细胞中采用一种非蛋白酶的逆行灌注微念珠携带法，但需较大的组织标本，且不排除大血管内皮细胞污染的可能性。③D－Hanks溶液冲洗3次，去除胰蛋白酶和EDTA，此时部分表皮可能已经脱落。④将组织片置于培养基中，用刀片轻擦去表皮，将真皮组织置于新鲜培养基中。⑤用刀片轻压组织块，由中央向周边移动，内皮细胞即可释放入培养基中。⑥将多块组织释放的内皮细胞收集在一起，800g离心1min（另有报道110g离心5min，或450g离心10min），沉淀重新悬浮于新鲜培养基中。⑦倒入培养基中培养。⑧包皮外板和胎儿其他部位皮肤同成人皮肤分离方法。

（二）成人皮肤微血管内皮细胞的分离培养

1．薄片组织灌注法　成人皮肤较厚，真皮结缔组织较致密，消化前需用角膜刀切成0．2mm×0．3mm厚的薄片，其他步骤和胎儿包皮内板皮肤分离方法相同，称为“薄片组织灌注法”，该种方法是从成人皮肤分离内皮细胞最有效的方法。

2．Dynabeads免疫磁珠法　适用于较大标本的分离，一般要求＞10cm×10cm。荆豆血凝素A（UEA－1）是内皮细胞较特异的标志之一，它能与内皮细胞表面的糖蛋白的岩藻糖结合，当UEA－1包被的磁珠和粗制内皮细胞悬液一起孵育时，通过磁场的作用使内皮细胞纯化。Dynabeads磁珠不仅可以用于内皮细胞分离，也可用于内皮细胞传代培养时的纯化。其操作程序为：①将已获取的真皮组织块置于消化液中（内皮细胞培养基中加10%胎牛血清，300U／ml粗制胶原酶和透明质酸酶，每20cm×20cm皮肤加10ml消化液），37℃消化3h，最好在恒温水浴摇荡床上，每分钟175转，另可放入一小的搅拌棒以加强消化效果。②收集上清，未消化的组织块置入培养基中轻轻挤压，收集上清，如此重复3次，除去沉渣。③上清用500μm和100μm组织培养筛网依次滤过。④450g离心10min，沉淀悬浮于180μl HanKs溶液（含0．5%FBS）和20μl UEA－1包被的磁珠。⑤细胞磁珠混合液缓慢旋转20min，然后倒入加有10ml Hanks溶液的试管中。⑥将试管放入磁性分子浓缩器中，去除未结合的细胞成分。⑦将⑤、⑥步骤重复3次，最后将细胞磁珠混合液悬于2ml内皮细胞培养基中。

（三）微血管内皮细胞的传代和纯化

分离的微血管内皮细胞混有大量的其他细胞成分，如Fb、血管平滑肌细胞等，血管内皮细胞的纯化是一项艰巨的工作，是微血管内皮细胞分离成功与否的关键。现已有多种方法可以采用，如亚细胞克隆法、免疫磁珠法、流式细胞仪法，以及采用选择性内皮细胞培养基等。

1．将细胞悬液倒入明胶包被的培养板上，接种量一般为每4cm×4cm皮肤接种于一个明胶包被的24孔板的一个孔，37℃、5% CO2孵育2～3h，细心除去上清，再加入新鲜的选择性内皮细胞培养基继续培养。根据经验证明，2～3h孵育已足以让内皮细胞附壁，其他细胞尚未附壁，此时即可去除其他细胞。初代培养后偶有少量污染细胞，可以采用机械法去除。原代培养细胞融合后，可用消化液分散细胞传代，每2周更换2次培养基。

2．大量组织分离纯化内皮细胞可采用Dynabeads免疫磁珠。但小块组织不用于磁珠法，因为会造成细胞丢失过多。

3．也可采用流式细胞仪分离纯化内皮细胞，但需要采用分选式细胞仪、纯化时要避免细胞聚集，防止细菌污染。

二、常用的内皮细胞培养基

（一）M199

为分离人血管内皮细胞最常用的培养基。补充4mmol／L谷氨酰胺、20%胎牛血清（FBS）、肝素50μg／ml、ECGF内皮细胞生长因子、二丁基－cAMP（dibutyryl cAMP）5．0× 10－4 mol／L、异丁基甲基黄嘌呤（IMX）3．3× 10－5 mol／L、200U／ml青霉素、0．1μg／ml链霉素。

（二）改良的Iscove培养基

基本成分为DMEM，补充成分胸苷（thymidine）1．5×10－5 mol／L、次黄嘌呤（hypoxanthine）1．0×10－4 mol／L、二丁基cAMP（dibutyryl cAMP）5．0×10－4 mol／L、异丁基甲基黄嘌呤（IMX）3．3×10－5 mol／L、8% FBS、2%孕妇血清。

（三）CS－C培养基

为内皮细胞选择性培养基，含有谷氨酰胺、HEPES、碳酸氢盐等，每100ml需补加ECGF 5mg，不需另加其他成分，但价格昂贵。

三、微血管内皮细胞的鉴定

至今为止，微血管内皮细胞尚无特异性表面标志。微血管内皮细胞的鉴定主要还是根据器官和组织的起源，从形态、表型、生化和功能等方面进行综合评价。

（一）生长形态

在光镜下观察，生长融合状态下的内皮细胞呈铺路石样。

（二）超微结构

细胞表面存在微绒毛、窗孔。内皮细胞胞浆内可见特异性怀布尔－帕拉德小体（Weibel－palade body）。

（三）免疫组化

CD31、CD34、凝血调节蛋白、肝素盐糖蛋白、PDGF受体、Ⅷ因子相关抗原染色阳性。

（四）功能

用PDGF刺激2～3h可形成毛细血管样网络。

四、内皮祖细胞的分离培养

（一）分离

从脐血或外周血中分离内皮组细胞。

1．收集脐血或外周血，肝素抗凝（25U／ml）。

2．用羟乙基淀粉去掉部分红细胞。

3．Ficoll液（比重1．077）密度梯度离心纯化单个核细胞（每分钟2 000转，离心30min）。

4．CD34免疫磁珠提取内皮祖细胞。

5．培养板用胶原或纤维粘连蛋白包被。

6．采用M199内皮细胞选择性培养基或EBM－2培养基。培养基中加有VEGF、bFGF、IGF－Ⅰ、EGF。先用含5%胎牛血清的培养基中培养，7d后再转种到含20%胎牛血清的培养基中培养。

EPC具有较强的增殖能力，在体外传代20倍以上仍有较强的生长活力。研究发现，免疫磁珠会降低内皮祖细胞的增殖贴壁能力，实践中可省略免疫磁珠步骤。

（二）鉴定

可用免疫组化检测CD34、VEGFR－2、AC133。

（阎国富）

参 考 文 献

［1］张延龄．血管内皮的正常和病理生理学．国外医学·创伤与外科基本问题分册，1994，15（4）：193

［2］何天源，陈诗书．血管内皮生长因子与血管生成．国外医学·分子生物学分册，1997，19（2）：236

［3］娄晋宁．微血管内皮细胞的培养及其在医学研究中的应用．微循环学杂志，2004，14（3）：5

［4］于海莹，崔磊，曹谊林．内皮祖细胞（EPCs）研究进展．中国生物工程杂志，2003，23（8）：7

［5］Amoroso，Del－Porto F，Di－Monaco C，et al．Vascular endothelial growth factor：a key mediator of neoangiogenesis．A review．Eur Rev Med Pharmacol Sci，1997，1（1－3）：17

［6］Blann A，Seigneur M．Soluble markers of endothelial cell function．Clin Hemorheol Microcirc，1997，17（1）：3

［7］Ruszczak Z，Schwartz，RA．Vascular endothelium in the regulation of immune response．Res Commun Mol Pathol Pharmacol，1996，94（1）：3

［8］Normand J，Karasek MA．A method for the isolation and serial propagation of keratinocytes，endothellal cells，and fibroblasts from a single punch biopsy of human skin．In Vitro Cell Dev Biol Animal，1995，31：447

［9］Boyce ST．Fabrication，quality assurance，and assessment of cultured skin substitutes for treatment of skin wounds．Biochem Eng J，2004，20：107

［10］Erdag G，Medalie DA，Rakhorst H，et al．FGF－7Expression Enhances the Performance of Bioengineered Skin．Mol Ther，2004，10（1）：76

［11］Nomi M，Atala A，Coppi PD，et al．Principals of neovascularization fortissue engineering．Mol Aspects Med，2002，23（6）：463

［12］Kannana RY，Salacinskia HJ，Sales K，et al．The roles of tissue engineering and vascularisation in the development of micro－vascular networks：a review．Biomaterials，2005，26（14）：1857