脂肪源性干细胞

有学者认为，脂肪来源的基质细胞可表现出向多种细胞分化的潜能，一是脂肪组织中本身存在多种分化潜能限定的前体细胞，如前成骨细胞、前成肌细胞和前脂肪细胞；二是其他组织来源的干细胞（如血管周细胞、周围血中的间充质干细胞）；三是以上2种细胞群的混合物。切除的脂肪组织经消化后离心形成的细胞层含有前脂肪细胞，能够分化为脂肪细胞，因此观察到的脂肪细胞分化可能由于前脂肪细胞向脂肪细胞分化的结果，而不是多能干细胞向脂肪细胞分化的结果。但是加工过的脂肪吸取物（processed lipoaspirate，PLA）与MSCs类似，都能够向成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和软骨细胞分化，而且PLA表达的CD抗原与MSCs类似。单克隆的细胞具有向成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、神经细胞和软骨细胞分化的能力，证实脂肪组织中确实存在干细胞。

一、ADSCs生物学特征

（一）形态和生长特点

细胞呈平行排列，漩涡样生长，细胞为梭形，胞质和核仁丰富。300ml的脂肪组织经处理可常规产生（2～6）×108个ADSCs细胞，经过多次传代（10～20代），细胞的增殖速度无明显减慢，衰老和死亡细胞所占比例也很少，表明脂肪组织蕴含丰富的ADSCs细胞，且细胞体外扩增能力很强，易于传代培养。

（二）免疫表型

其免疫表型与已经报道的BMSCs相似。用流式细胞仪和免疫组化方法研究发现，体外培养的ADSCs细胞可表达如下蛋白：①黏附分子。它始终表达tetraspan蛋白（CD9）、整合素β1（CD29）和α4（CD49d），还表达细胞间黏附分子1（ICAM－1，CD54）、endoglin（cd102）、血管细胞黏附分子（VCAM、CD106）及活化的淋巴细胞黏附分子（ALCAM，CD166）。但不表达神经细胞黏附分子（NCAM，CD56）、细胞间黏附分子3（ICAM－3，CD50）、整合素αb（CD11b）和β2（CD18）及内皮选择蛋白（E－selectin，CD62）。②分子受体。可表达透明质酸盐（CD44）和转铁蛋白（CD71）的受体。③细胞外基质蛋白和糖蛋白。ADSCs能生成Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、Thy－1（CD90）和MUC－18（CD146）。④肌蛋白。能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白。⑤造血细胞标记。不表达造血细胞标志物CD14、CD31或CD45。⑥补体调节蛋白。确定能表达衰变加速因子（CD55）和补体蛋白；⑦组织相容性抗原：表达Ⅰ类组织相容性蛋白HLAABC，而不表达Ⅱ类蛋白HLA－DR。

二、ADSCs分化潜能

（一）向成骨细胞分化

诱导培养基是往DMEM培养基中加入10%胎牛血清、0．1μmol／L地塞米松、50μmol／L维生素C、10mmol／Lβ－甘油磷酸钠。培养2周后约有50%的细胞表达碱性磷酸酶，在培养板中有钙化斑。

（二）向脂肪细胞分化

诱导培养基是含10%胎牛血清的DMEM培养基中加入0．5mmol／L异丁基甲基嘌呤（isobutyl－methylxanthine，IBMX）、1μmol／L地塞米松、10μmol／L胰岛素和200μmol／L吲哚美辛、33μmol／L生物素、17μmol／L泛酸盐，培养2周后部分细胞分化为脂肪细胞，即使长时间培养，ADSCs也会维持这种分化能力。不用诱导分化剂也有少数ADSCs分化为脂肪细胞。

（三）向软骨细胞分化

诱导培养基是含1%胎牛血清的DMEM培养基，加入6．25μg／ml胰岛素、10ng／ml TGF－β、0．1μmol／L地塞米松、6．25μg／ml转铁蛋白和50nmol／L维生素C，诱导分化后的细胞表达Ⅱ型胶原，阿立新蓝染色阳性，多次传代培养后仍维持向软骨细胞分化的能力。

（四）向成肌细胞分化

诱导分化的培养基是含10%胎牛血清的DMEM培养基中加5%马血清、0．1μmol／L地塞米松、50μmol／L氢化可的松。分化成肌细胞的比例为总细胞的12%左右。诱导一段时间，培养皿中出现多核的细胞，早期分化的细胞表达肌源性决定因子（myogenic determination factor1，MyoD1），终末分化融合的骨骼肌细胞表达肌球蛋白。

（五）向神经细胞分化

人类ADSCs在氮胞苷的诱导下能够分化为神经细胞，表达神经元和星形胶质细胞的标志物，ADSCs移植到侧脑室，能够移行到脑的不同区域，广泛分布。大脑中动脉栓塞后，移植的ADSCs更容易向损伤部位移行，并且能够改善动物模型的疾病症状，分化的细胞可以表达神经细胞的相关蛋白。早期分化的细胞能够表达巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶，而晚期表达神经微丝200。对恒河猴脂肪组织来源干细胞的研究发现，在无血清培养基和bFGF、EGF、BDNF（brain－derived neurotrophicfactor）的诱导下，细胞能够形成类似神经干细胞的神经球，贴壁后分化为神经细胞。与骨髓基质细胞相比，脂肪组织来源的细胞更容易向神经细胞分化。对小鼠的ADSCs的研究证明，它能够表达神经元和胶质细胞表型，可表达γ－氨基丁酸、谷氨酸受体NR－1和NR－2亚单位、GAP－43、突触蛋白Ⅰ和电压控制型钙通道（voltagegated calcium channels），分化的细胞可对谷氨酰胺激动剂5－NMDA（N－methyl－D－aspartate）的刺激发生反应。

（六）向内皮细胞分化

人类皮下脂肪组织来源的非脂肪基质细胞在体外能够分泌VEGF、HGF、TGF－β，在缺氧条件下培养细胞时，VEGF的分泌增加5倍。在用缺氧条件下获得的ADSCs进行条件培养时，能够明显促进内皮细胞增殖，抑制内皮细胞凋亡。新分离的人脂肪组织的基质血管层（stromal vascular fraction，SVF）含有大量CD34（＋）、CD133（＋）和ABCG2（＋）细胞，而且部分CD34（＋）细胞可以分化表达内皮细胞标志物CD31，免疫磁珠分选CD34（＋）／CD31（－）细胞进行培养，发现这种细胞在一定条件下可以分化为内皮细胞。在后肢缺血小鼠动物模型的实验中，静脉注射CD34（＋）／CD31（－）细胞使缺血肢体的血流和毛细血管密度增加，移植细胞参与新生血管的生成，证明人类SVF中CD34（＋）／CD31（－）的群体细胞具有内皮祖细胞（干细胞）的性质，对于缺血性疾病的治疗有一定的应用价值。去分化的成熟人类脂肪细胞在体外可以很快获得内皮细胞表型，分化为内皮细胞，移植到体内参与血管生成，促进裸鼠缺血肢体的新血管生成，形成血管样结构，结果提示内皮细胞与脂肪细胞可能拥有共同的祖细胞（干细胞）。

（七）向心肌细胞分化

人类ADSCs在大鼠心肌细胞提取物的诱导下可以分化为心肌细胞，表达心肌细胞的标志物sarcomeric－α肌球蛋白、肌动蛋白、结蛋白和心肌肌钙蛋白Ⅰ、缝隙连接蛋白43（connexin 43），可见双核和有斑纹的细胞，并可见细胞的随机跳动。小鼠的ADSCs在不用5－氮胞苷的诱导条件下也可分化为心肌样细胞，具有心肌细胞的超微结构，表达心肌细胞的特异标志物，早期的培养还可以检测到细胞的起搏活动，肾上腺素激动剂能够增加细胞的收缩节律，而胆碱能激动剂会降低细胞的收缩节律。