虽然组织工程化组织和器官的研究已经取得了骄人的成绩，但面对临床应用的苛刻要求，对于该类产品的安全性研究仍需要进一步深入。我们对制备的复方壳多糖组织工程皮肤的主要成分、包含有组织工程皮肤制备过程中产生的各种活性因子的陈旧培养基及组织工程皮肤的浸提物进行生物安全性评价，主要包括常用的热原反应、急性毒性实验等10余项实验。
一、常用动物学实验
（一）热原反应
将连测5d肛温正常的12只成年新西兰家兔随机分为4组；经腹腔注射，分别给予基础培养基、醋酸鼠胶原溶液、2%枸橼酸壳多糖溶液、组织工程皮肤陈旧培养基1ml，1h后测兔肛温，并记录；连续7d，每天上午9时下午5时，测定兔肛温。
（二）皮内注射实验
所用动物为接受热原反应的1～6号家兔（热原反应均未见异常），实验前2d双侧兔背用8%硫化钠脱毛备皮，范围左右各5cm× 5cm大小；注意硫化钠作用时间不能太长；根据家兔编号按左右背顺序依次给予组织工程皮肤花生油浸出物、0．9%NaCl溶液、2%枸橼酸壳多糖溶液皮内注射，每侧注射区选5点，各点间距2cm，每点注射0．2ml；注射后15min、1h、1d、2d、3d，观察是否有红斑、水肿等皮肤反应，并照相记录。
（三）皮肤致敏实验
将18只健康成年白色豚鼠称重，随机分为组织工程皮肤组、基础培养基组和阳性对照组；实验前2d用8%硫化钠脱去豚鼠左背皮毛，清洗干净；组织工程皮肤组豚鼠左背备皮区贴敷组织工程皮肤5min，基础培养基组和阳性对照组豚鼠左背分别涂敷0．1ml基础培养基和0．05%的2，4－二硝基氯苯；第7天、第14天重复给予上述处理因素；第28天豚鼠右侧脱毛备皮，再次给予相对应的处理因素，并连续3d观察有无皮肤充血、红肿、硬结出现；判断皮肤反应，记分标准见表14－2。刺激反应总评判定：0分为无刺激；≤1．9分为轻度刺激；2．0～4．9分为中度刺激；5．0～8．0分为强刺激。
表14－2 皮肤刺激反应评分表
（四）全身过敏实验
称重12只健康成年豚鼠，并随机分为实验组和阳性对照组；实验组豚鼠腹腔隔日注射0．5ml组织工程皮肤陈旧培养基，阳性对照组则腹腔注射0．05%的2，4－二硝基氯苯0．5ml；第14天、第21天再分别注射上述溶液，观察有无异常反应，如抓鼻、竖毛、惊厥反应等。
（五）眼结膜角膜刺激实验
所用动物系接受热原反应的7～12号家兔（无眼疾）；按照自身左右对照设计，对每一家兔左、右眼分别给予组织工程皮肤陈旧培养基和基础培养基100μl；滴液后利用眼科中心的TRC 50XRetinal Camera连续7d观察兔眼有无充血水肿、局部组织破损等发生。
（六）经口急性毒性实验
称重健康Wistar大鼠20只；将组织工程皮肤剪碎，并加入50%陈旧培养基，制成混合物；采用灌胃染毒法，按2ml／100g体重将上述混合物经口灌胃染毒，间隔4h进行1次，连续3次；记录14d内大鼠中毒症状和死亡情况。
（七）皮下埋植急性毒性实验
称重健康Wistar大鼠15只，按2∶1随机分为实验组和对照组，并在实验前2d将鼠背脱毛备皮；5%异戊巴比妥麻醉，常规消毒大鼠背部脱毛区，按无菌操作原则切开背部皮肤，并适当钝性分离皮下组织；实验组按11g／kg体重的量在皮下埋植组织工程皮肤，间断缝合；对照组切开皮肤并适当分离皮下组织后即予以缝合；覆盖清洁纱布后单笼饲养，观察创面情况，第14天称重；将测得的体重数据用SPSS 8．0统计软件协方差分析，P＜0．05为统计学存在显著差异；反之，则无显著差异。将埋植半月的组织工程皮肤进行常规固定，做组织学检查。
（八）静脉急性毒性实验
将15只成年昆明小鼠（雌7雄8）和15只成年Wistar大鼠（雌8雄7）称重，并随机分为高温浸出液、低温浸出液和0．9%NaCl溶液组；将40g组织工程皮肤平均浸入两瓶100ml的0．9%NaCl溶液中，分别在120℃和37℃条件下浸出24h，制成高温浸出液和低温浸出液备用；对实验各组按50ml／kg体重分别经尾静脉缓慢注射高温浸出液、低温浸出液和0．9%NaCl溶液；连续观察2周，隔日称重。将测得的体重数据用SPSS 8．0统计软件协方差分析，P＜0．05为统计学存在显著差异；反之，则无显著差异。
（九）溶血实验
取一成年未孕雌性新西兰家兔，抽血2ml，用100ml的0．9%NaCl溶液稀释成2%悬液；在10支清洁试管中分别加入2ml兔血悬液，每2支为1组，分别加入高温浸出液、低温浸出液、0．9%NaCl溶液、双蒸水2ml，以及剪成1mm×1mm×2mm大小的组织工程皮肤2g，轻轻摇匀后，37℃水浴1h；观察各试管有无红细胞凝集现象，每分钟1 000转，离心5min；分别吸上清1ml移至另外10支试管，加入0．1%Na2CO3液4ml，摇匀后在721分光光度计540nm波长下测各样本的光密度；计算溶血率＝（样品吸光度－阴性对照吸光度）／（阳性对照吸光度－阴性对照吸光度）
（十）降压物质检查实验
称重3只成年雄性家猫；配制磷酸组胺标准品对照液（1mg／ml）和稀释对照液（0．5μg／ml）、肝素高浓度稀释液（500U／ml）和低浓度稀释液（25U／ml）；按异戊巴比妥100g／kg体重麻醉动物，分离颈动脉、静脉，按肝素500U／kg体重腹腔注射高浓度肝素，动、静脉分别插三通管（含低浓度肝素）；静脉插管为给药通道，动脉插管与多功能生理记录仪相连；静脉推注0．05μg／kg、0．1μg／kg、0．15μg／kg磷酸组胺，重复3次，观察血压改变，考察动物的灵敏度；按0．1μg／kg组胺、5ml／kg浸出液、5ml／kg浸出液、0．1μg／kg组胺顺序，静脉快速给药，观察血压变化；浸出液分为高温浸出液和低温浸出液两种。
（十一）升压物质检查实验
称重3只成年雄性Wistar大鼠；配制垂体后叶素标准品溶液（1U／ml）和标准品稀释液（0．1U／ml）、甲磺酸酚妥拉明液（1mg／ml）、肝素高浓度稀释液（500U／ml）和低浓度稀释液（25U／ml）；按异戊巴比妥100g／kg体重麻醉动物，分离颈动脉、静脉，按肝素500U／kg体重腹腔注射高浓度肝素，动静脉分别插三通管（含低浓度肝素）；静脉插管为给药通道，动脉插管与多功能生理记录仪相连；静脉缓慢推注酚妥拉明（0．1mg／100g体重），10min后重复一次，观察血压变化；观察血压变化是否符合实验需要模型；按0．1U、0．01U、0．002U垂体后叶素轮流静脉给药，重复3次，观察血压改变，考察动物的灵敏度；按0．002U垂体后叶素（0．1ml）、0．1ml浸出液、浸出液、垂体后叶素顺序，静脉快速给药，观察血压变化；浸出液分为高温浸出液和低温浸出液两种。
（十二）微核实验
将30只成年昆明小鼠（雌雄各半）称重，随机分为实验组、阴性对照和阳性对照组。各组小鼠分别尾静脉注射给予50ml／kg高温浸出液、腹腔注射环磷酰胺80mg／kg、尾静脉注射0．9%NaCl溶液50mg／kg；24h后重复上述处理；再过6h处死全部动物；解剖小鼠，取出胸骨，挤压出骨髓进行涂片，每只小鼠涂片2张，过夜；骨髓片染色：瑞氏染液4滴，染色1～2min；加稀释液5滴，保留5～10min后用自来水缓慢冲洗；在油镜下阅片，每只小鼠计数10 000个多染红细胞，计算微核出现千分率。
二、结果评价
（一）热原反应
所有动物在接受DMEM、胶原溶液、壳多糖溶液和组织工程皮肤陈旧培养基腹腔注射后，均未出现明显的体温变化，其中，DMEM组体温波动在39．40～39．80℃，胶原组体温波动在39．36～39．79℃，壳多糖组体温波动在39．31～39．78℃，组织工程皮肤陈旧培养基组体温波动在39．39～39．74℃，体温波动均未超过阳性标准。说明组织工程皮肤没有热原存在。给予各种处理因素前后的具体体温变化见图14－1和图14－2。
（二）皮内注射实验
两组浸出物在新西兰家兔左、右两侧背部行自身左右对照，皮内注射后15min、1h、2d、3d及4d均未引起实验区的红斑、水肿反应，显示组织工程皮肤对动物机体没有刺激反应，提示动物对组织工程皮肤的主要成分有很好的耐受性。
（三）皮肤致敏实验
图14－1 胶原组与DMEM组动物体温波动图
图14－2 壳多糖组和陈旧培养基组动物体温波动图
表14－3 复方壳多糖组织工程皮肤的皮肤原发刺激实验结果
白色豚鼠雌雄各半，体重（284±31．36）g。在给予基础刺激的过程中，所有的动物均未出现充血、红肿，说明包括组织工程皮肤在内的所有处理因素对动物而言均无明显的刺激作用，提示早期耐受性好。而在再次给予相应的刺激后，接触组织工程皮肤与外涂敷DMEM的豚鼠均未出现充血、红肿现象，阳性对照组中却不同程度地出现了充血、红斑及皮下硬结，其中皮下硬结2例（2／6），评分结果见表14－3。说明组织工程皮肤对个体皮肤没有致敏作用，再次接触一般也不会引起机体的变态反应。实验中未出现动物死亡。
（四）全身过敏实验
成年健康豚鼠雌雄各半，体重（245± 34．85）g。在实验进行的第14天时，所有动物均未出现异常表现，而在第21天，注射组织工程皮肤陈旧培养基的豚鼠无1例出现异常反应，而在注射0．05%2，4－二硝基氯苯0．5ml的豚鼠中，全部出现不同程度的异常表现，如竖毛、抓鼻等，有2只在注射后6h、18h后死亡。说明复方壳多糖组织工程皮肤的陈旧培养基不会引起动物全身变态反应，也就说明将该组织工程皮肤移植到动物机体内，一般不会有全身变态反应发生。
（五）眼结膜角膜刺激实验
6只兔子的左、右两侧眼结膜角膜在滴加组织工程皮肤陈旧培养基和DMEM后，在1周的观察中，均未发现有充血水肿、局部组织破损等现象发生。说明组织工程皮肤对眼结膜角膜没有刺激性，在今后移植到个体后，即使因意外不慎将组织工程皮肤与眼角膜结膜接触，也无妨害。
（六）经口急性毒性实验
参加本实验的大鼠雌雄各半，体重（194．85±11．93）g。所有动物在灌胃染毒后均无异常表现，无1例出现呕吐、腹泻，1h左右恢复正常进食。染毒后14d内大鼠均存活，体重均有增加。
（七）皮下埋植急性毒性试验
大鼠雌7雄8，体重（196．67±10．98）g。两组动物在麻醉苏醒后均较快恢复活动，未发生麻醉意外，也无动物中毒死亡。所有创面均未出现感染，术后第12天左右实验组皮下所植入的组织工程皮肤，已经变小，质地较硬，第14天时有2例不易触及皮下植入物。经SPSS 8．0统计软件分析，方差齐性的Levene检验的P＝0．617，按α＝0．05的检验水准，接受无效假设，可认为术后动物体重的残差方差齐性。不同处理因素间的方差F＝3．121，P＝0．103，按α＝0．05的检验水准，接受无效假设，可认为调整均数间差异不显著，即皮下埋植组织工程皮肤与否对动物体重增加的影响没有统计学意义，也就是说皮下组织工程皮肤埋植不会影响动物体重的增加。分析各因素，具体目标效应检验值见表14－4。
表14－4 各目标效应检验（tests of between－subjects effects）
将皮下埋植半个月的组织工程皮肤进行组织学检查时，可见组织工程皮肤大致结构没有改变，在原先的HDF间浸润有大量淋巴样细胞，但分布均匀，未形成肉芽肿样结构。
（八）经静脉急性毒性实验
实验前小鼠体重（27．27±1．75）g，大鼠体重（201．00±10．08）g。给予不同处理因素的3组动物，均未出现明显的毒性反应，各组动物活动正常，体重增加。利于SPSS 8．0统计软件，对实验前后动物的体重进行协方差分析，由于本实验采用的是随机区组设计，因此，将不同的处理因素（静脉注射的不同供试品）、同组别不同个体进行及实验前体重作为目标因素观察组间有无明显差别，结果显示各个因素间均无明显差异。给予高温浸出液和低温浸出液的动物体重增加与给予0．9% NaCl溶液的动物体重增加无统计学差异（F＝0．200，P＝0．820），相同处理因素组内的不同个体也无统计学差异（F＝0．210，P＝0．989），而处理前的体重与处理后的体重有明显的线性关系（F＝47．252，P＝0．000）（表14－5）。
表14－5 各目标效应检验（tests of between－subjects effects）
（九）溶血实验
组织工程皮肤直接接触后的溶血率为1．8%，其余各组均为0，远小于规定的不大于5%的阳性标准，说明组织工程皮肤植入机体后不会引起溶血反应，对血液系统没有不良反应。溶血率见表14－6。
表14－6 组织工程皮肤溶血实验结果
（十）降压物质检查实验
所有动物在静脉推注不同浓度的组胺标准品溶液后所显示的血压改变波形，均符合测定降压物质要求。反复静脉推注组织工程皮肤高温浸出液与低温浸出液后，血压的变化均未超过阳性对照的1／2，表明组织工程皮肤无降压物质反应。
（十一）升压物质检查实验
所有大鼠在静脉推注不同浓度的垂体后叶素标准品溶液后所显示的血压改变波形，均符合测定升压物质所要求的血压模型。反复静脉推注组织工程皮肤高温浸出液与低温浸出液后，所有动物的血压均未明显变化，远未超过阳性对照的1／2，表明组织工程皮肤无降压物质反应。
（十二）微核实验
雌性小鼠体重（25．67±1．54）g，雄性小鼠体重（27．47±7．63）g。结果发现环磷酰胺处理后的小鼠骨髓中可见较多的微核，平均微核检出率为8．23%；而用高温浸出液处理的小鼠骨髓中微核很少见到，平均检出率为2．17%，与0．9%NaCl溶液处理的阴性对照组（1．76%）相当。微核检出情况见表14－7。
表14－7 微核实验结果
实验组微核检出率远低于5%的药典规定的阳性标准，说明组织工程皮肤无致突变反应。经过SPSS 8．0软件统计分析，FA＝180．543，可以认为不同处理因素是引起微核出现率不同的主要原因，而与性别无关，且处理因素与性别因素也不存在交互效应。处理因素的观察效能为1．000，也同样说明不同处理因素的检验效能最大。由此可见，环磷酰胺处理因素是引起骨髓中微核出现增多的重要因素，而高温浸出液与0．9%NaCl溶液一样，不会引起微核的异常增多。
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