其他评价指标

依据1998年《用于医疗器械制造的动物组织及其衍生物》中的要求，对于源自动物的医疗器械产品，必须控制动物原料的产地，并对使用的动物进行常见和易发疾病的检疫工作。如在欧洲等疯牛病高发区，对牛源原料，必须进行疯牛病的检疫。为了避免动物组织或血液等原料中存在的潜在危害，必须进行相关的人畜共患病检测。由于我国境内并未出现疯牛病报道，历史上也未曾是疯牛病的疫区，因此，国家食品药品监督管理局认为可以免除对以国产牛为原料生产的生物制品进行疯牛病的检测。

由于组织工程产品中所需的活细胞源自人体，因此，需要对产品进行甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒病原体、支原体等病原微生物的检测；而以牛跟腱为原料提纯的胶原蛋白则需要检测口蹄疫病毒、炭疽杆菌。此外，为保证组织工程产品的安全性，还必须进行细菌、真菌等微生物的检测。

一、口蹄疫的检疫

口蹄疫的检测一般采用反向间接血凝试验。

（一）仪器和试液

96孔微型聚苯乙烯血凝滴定板、WZ－2微量振荡机、滴定管、移液管。

稀释液（TPBS）Ⅰ：由NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、PVP、吐温－80、NaN3和0．05%浓度的牛血清配制而成。

稀释液Ⅱ：聚乙二醇、兔血清、NaN3和pH为7．2的磷酸缓冲溶液混合配制而成。

标准阴性血清、标准抗原、敏化红细胞诊断液、供试品。

（二）实验步骤

供试品先进行前处理，然后将处理后的供试品分别置于8个试管中，自第1管开始由左至右用稀释液进行对倍稀释（即1∶6、1∶12、1∶24、…1∶768），每管体积0．5ml即可。在血凝滴定板上第1至第5排，每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品2滴，每排的第7管稀释被检样品2滴，依此类推至第1孔。每排的第9孔滴加稀释液2滴作为稀释液对照，每排的第10孔按顺序分别滴加标准抗原A、O、C、AsiaⅠ和口蹄疫标准抗原各2滴作为阴性对照。其后，分别向滴定板的第1排至第5排孔滴加标准抗原A、O、C、AsiaⅠ和口蹄疫敏化红细胞诊断液，每孔1滴，振荡机上摇匀1～2min，于20～35℃下静置2h。

（三）结果评价

具体判定标准可参见表14－8。

表14－8　口蹄疫检测判定标准

二、炭疽杆菌的检疫

炭疽病的检测可以采用环状沉淀实验、琼脂凝胶沉淀弥散实验、补体结合实验和间接血凝实验。通常由于环状沉淀实验操作简便、实验速度快和费用较低等优点而被广泛使用。

（一）环状沉淀实验法

先将供试品切碎，加水煮沸后，用滤纸过滤。弃去滤渣，将滤液叠加于小管内的免疫血清面上，在37℃恒温箱中放置10～15min。若两液接触面出现白色沉淀环，即为阳性，证明滤液中有炭疽杆菌的多糖质抗原；反之，则判为阴性。

该实验的特异性不高，可能会出现假阳性反应。

（二）血清学诊断法

取供试品或待测牛血清与炭疽杆菌抗原做琼脂凝胶沉淀弥散实验、补体结合实验或间接血凝实验。上述这3种方法均可用来进行炭疽杆菌的检疫。

三、甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、支原体和梅毒的检测

（一）甲肝的检测

甲肝是一种由甲型肝炎病毒（HAV）引起的血液性疾病。甲肝的检测一般采用核酸杂交，聚合酶链反应（PCR）检测HAV RNA。生物制品检测甲肝是测定甲肝病毒的抗HAV－IgM。

（二）乙肝的检测

乙肝是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的血液性疾病。乙肝的潜伏期较长，一般为60～160d。乙肝病毒可能引起的患者病症有急性肝炎、慢性肝炎和重症肝炎等。乙肝的检测方法有通过血清学方法检测HB－sAg、抗－HBs、HBeAg、抗－HBe及抗－HBc等乙肝抗原、抗体是否存在。

（三）丙肝的检测

丙肝是一种于1989年才被命名的血液性疾病。大多数丙肝患者均不出现症状，发病时呈现慢性过程。丙肝的检测方法有检查病毒的RNA或检查抗体。其中，一般使用检查抗体法，即用酶联免疫法检测抗－HCV（丙肝病毒简称为HCV）是否呈阳性反应。

（四）梅毒的检测

梅毒是一种由梅毒螺旋体的寄生虫所引起的性病，该病原体可以通过胎盘进入胎儿血液中。梅毒的检测是采用血清学检测实验，即非螺旋体抗原实验和螺旋体抗原实验（荧光梅毒螺旋体抗体吸收、梅毒螺旋体血凝实验和梅毒螺旋体制动实验）。此外，还可采用聚合酶链反应（PCR）法检查TP DNA，用免疫印迹法检测与TP 47kDa抗原发生反应的IgM。

（五）支原体的检测

支原体是细胞外可以生存的最小生命体。生物制品中若存在大量繁殖的支原体，则出现严重的质量问题。检测方法，可将组织工程皮肤产品或其培养液加入至支原体培养基中，在37℃情况下培养48h，观察指示剂变化情况。若培养基颜色变为红色或近似红色，则为阳性。

（六）艾滋病的检测

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的一种获得性免疫缺陷综合征。血液传染是该疾病传播的主要途径之一。艾滋病检测是检测其抗体，即通过使用ELISA、IFA、RIA和免疫印迹实验（WB）来进行检测。目前，对于胶原蛋白制品检测上述这5项疾病病原体均可采用相应的诊断试剂。

四、无菌实验

（一）仪器和试液

超净工作台、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱。

培养基：营养琼脂、液体马丁、硫乙醇酸钠，培养基在使用前需置压力蒸汽灭菌器内115℃灭菌30min，即得。

（二）供试品的制备

取组织工程皮肤4包，以无菌操作拆开包装，与不同部位分别剪取约100mg或1cm×3cm的供试品11份，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

（三）实验步骤

在使用前，细菌培养基必须经30～35℃培养48h，真菌培养基经20～25℃培养72h，证明无菌方可使用。

培养基质量检查：需氧菌、厌氧菌培养基经接种每1ml含100个以下的藤黄八叠球菌（28001）菌液1ml，置30～35℃培养24h后，应生长良好。需氧菌、厌氧菌培养基经接种每1ml含50个以下的生孢梭菌（54941）菌液1ml，置30～35℃培养24h后，应生长良好。真菌培养基经接种每1ml含50个以下的白色念珠菌菌液1ml，置20～25℃培养24h后，应生长良好。

每批供试液分别接种于需氧菌、厌氧菌培养基5管，其中1管接种金黄色葡萄球菌菌液1ml，做阳性对照；另接种于真菌培养基2管。接种后，需氧菌、厌氧菌培养基在30～35℃培养5d，真菌培养基在20～25℃培养7d。

（四）结果判定

当阳性对照管显混浊并确定有细菌生长时（应在接种后24h有细菌生长），可根据观察所得的结果判定。如需氧菌、厌氧菌及霉菌培养管均为澄清或虽显混浊但经证明并无菌生长，均应判为供试品合格。如需氧菌、厌氧菌及霉菌培养管中任何一管显混浊并确证为有细菌生长，应重新取样依法复试2次。除阳性对照管外，其他各管不得有细菌生长，否则应判为供试品不合格。如在加入供试液后，培养基出现混浊或沉淀，经培养不能从外观上判断时，可取该培养液转种入另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72h后，观察是否再现混浊或在斜面上有细菌生长，并在转种的同时，取少量培养液，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有细菌生长。

五、展 望

组织工程产品的临床应用仅仅是个开始，其产品标准、评价指标还处于摸索阶段。现阶段还有以下指标，应在安全性检测时予以考虑，如活细胞计数、牛血清白蛋白残留量、免疫原性检测等。

组织工程产品中活细胞的数量和活力是反映产品质量和功能的重要参数，因此在产品中建立本项检测内容的指标和检测方法是值得摸索的一个课题，目前尚无统一的标准，而且组织工程皮肤产品又往往涉及Fb和KC两种细胞，最佳的途径是建立统一的方法，不同的指标进行检测。由于产品的培养过程往往使用牛血清，因此在产品成熟后应当去除牛血清白蛋白的残留，尽可能地降低蛋白对人体的影响，目前多采用牛血清白蛋白的残留量来衡量牛血清的残留情况。

组织工程产品的免疫原性问题一直是研究者、国家相关管理机构和临床医师特别关心的问题，目前尚无合理的指标可供参考，混合淋巴细胞反应可作为一项较粗的指标来反映细胞免疫问题，但由于其重复性较差、影响因素较多，其结果仅供参考。

（鲁元刚）

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