促血管生成因子

血管生成的刺激因素包括有一类称为“促血管生成因子”（angiogenic growth factors）的细胞因子，起着刺激新血管形成的作用。目前已经发现了几十种血管生成刺激因子。常见的血管生长因子有bFGF、aFGF、VEGF、血管生成素、TGF－α和TGF－β、TNF－α、血小板来源的内皮细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、胎盘生长因子、IL－8、HGF、增殖素。现在研究最多的是bFGF和VEGF，两者具有协同作用。

一、血管内皮细胞生长因子

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是最初从豚鼠的腹腔肿瘤中分离得到的一种蛋白因子，是一种特异性作用于血管内皮细胞的生长因子。VEGF是促血管生成的主要调控生长因子，也是最重要的促血管生成因子。现已证实VEGF及其家族成员不仅在肿瘤血管生成，在其他生理和病理血管生成中都是必不可少的诱导因子。VEGF是一种内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体外能促进内皮细胞增殖，在体内可诱导血管发生，同时由于VEGF可以增强血管通透性，故又被称为血管通透性因子。

（一）VEGF的分子概述

VEGF可分为VEGF－A、VEGF－B、VEGFC和VEGF－D四种，我们常说的VEGF其实是指VEGF－A。VEGF－A由2条N端相同而其他区域存在某些差异的多肽链通过二硫键连接而成的高度保守糖蛋白二聚体，分子量34～42kDa。VEGF－A是一种糖基化多肽因子，其基因定位于6号染色体短臂1区2带（6p12）。基因转录的mRNA以不同的剪切方式形成6种VEGF－A异构体，分别含有115个、121个、145个、165个、189个和206个氨基酸残基，以二硫键连接成同源二聚体。其中，VEGF－A165是发挥生物学效应的主要成分。VEGF－A121、145／165为分泌性可溶性蛋白，VEGF－A189／206是以结合状态储存。VEGF－A表达于多种组织，如肺、肾、肾上腺、心脏、卵巢等已分化细胞和肿瘤细胞。缺氧是诱导VEGF－A及其受体产生的最有效因素。

VEGF－B基因定位于11q13，有7个外显子。基因转录出2种异构体，VEGF－B167和VEGF－B186，两者与VEGF－A165相似，都是二硫键连接的二聚体。2个异构体在N端有结构相同的115个氨基酸，但VEGF－B167的C端为碱性并富含半胱氨酸，可与肝素结合，而VEGF－B186的C端富含丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸，不与肝素结合，也不与细胞表面或细胞周围的硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合。VEGF－B167和VEGF－B186可通过二硫键与VEGF－A形成二聚体。在缺乏肝素条件下，VEGF－B167也可与VEGF－A165形成二聚体。VEGF－B表达于心脏、骨骼肌等组织。

VEGF－C基因定位于4q34。VEGF－C mRNA首先编码VEGF－C前体，通过蛋白分解作用形成成熟配体，其前体蛋白有N端信号多肽、N端前多肽、VEGF同源区和C端前多肽等4个区域。VEGF同源区与VEGF－A165有30%同源，与VEGF－B167有27%同源，与胎盘生长因子1（PGF－1）有25%同源。VEGF－C表达于心脏、肾、肺、胎盘、卵巢等正常组织和器官。缺血、缺氧、癌基因等条件刺激并不能增加VEGF－C表达，但血清和生长因子（如EGF、PDGF等）能促进VEGF－C的表达。

VEGF－D基因定位于Xp22．1，包括7个外显子和6个内含子。VEGF－D蛋白含有354个氨基酸，与VEGF－C有48%同源，与VEGF－A165有31%同源，与VEGF－B167有28%同源，与PGF有32%同源。在VEGF家族中，其蛋白质结构与VEGF－C最接近。VEGF－D可在心、肺、骨骼肌、结肠和小肠等许多正常组织大量表达。

（二）VEGF受体及信号传导机制

1．VEGF受体 VEGF的生物学效应是通过特异的膜受体介导实现的。迄今已发现VEGF的3种受体都为跨膜酪氨酸激酶受体，属于第三亚型，都有7个免疫球蛋白样的细胞外区域、跨膜区域和1个含有酪氨酸激酶的细胞内区域。VEGF就是通过与血管内皮细胞表面特异性受体结合而发挥其生物学效应的。

VEGF的3种受体在分布、结合配体及亲和力方面各不相同，这决定了3种受体在介导VEGF生理功能中各有不同分工。VEGF受体分别由3种基因编码：Fms样酪氨酸激酶－1（Flt－1）基因编码VEGFR－1，其作用是促进内皮细胞黏附和维持血管通透性，胎－肝激酶－1／含激酶插入区受体（Flk－1／KDR）基因编码VEGFR－2，与内皮细胞增殖和分化有关，Fms样酪氨酸激酶－4（Flt－4）基因编码VEGFR－3，主要作用是促进淋巴管形成。

Flt－1最初从人胎盘的cDNA库中用编码激酶保守区序列同源的寡核苷酸作引物筛选获得。Flt－1由小鼠cDNA文库分离得到，KDR是从人脐静脉内皮细胞cDNA文库分离到的Flt－1基因同源物，Flt－1和KDR序列高度同源。Flt4是从人红白血病细胞cDNA库中克隆而来，其结构与Flt－1／KDR、Flt－1基本相同，但它不含激酶插入区。目前，已发现30多种酪氨酸激酶受体，可分为9个亚型。VEGF受体Flt－1／KDR、Flt－1和Flt－4为酪氨酸激酶受体的第三亚型，其结构相似，即都包含7个细胞外类免疫球蛋白区、1个细胞内激酶区和1个单链跨膜区。

鼠的受体敲除实验表明，VEGF的3种受体基因中，任何一种被敲除都将导致小鼠血管生成障碍，并于胚胎期8～10d后死亡。Flt－1基因缺失的小鼠主要表现为内皮细胞成熟障碍，并有造血干细胞严重减少。KDR基因缺失的小鼠主要表现为大小血管内皮细胞受到损害。Flt－4基因缺失的小鼠则因血管管腔缺陷导致大血管发育异常。

VEGF－A主要是与VEGFR－1和VEGFR－2高亲和力结合。VEGF－B则主要是与VEGFR－1结合并激活此受体，也可以与VEGF－A形成二聚体。VEGF－C的受体是VEGFR－2和VEGFR－3。VEGF－D与VEGF－C一样，可以激活VEGFR－2和VEGFR－3两种受体。PGF可结合并激活VEGFR－1，其单体可与VEGF－A形成二聚体，再与VEGFR－2结合并将其激活。

2．信号传导机制 VEGF受体介导的信号转导与其他酪氨酸激酶受体非常相似。VEGF信号转导的第一步是活化受体，使其具有酪氨酸激酶活性。活化的受体进而可激活一系列下游信号分子，如磷脂酶、蛋白激酶、3－磷酸肌醇激酶、丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）等，并最终传递至细胞核内，通过特定基因的表达实现VEGF的生物学效应。

（三）VEGF的生物学功能

1．促进内皮细胞增殖 为VEGF的主要生物作用。VEGF是血管内皮细胞特异性的促有丝分裂原，具有强烈的促血管内皮细胞增殖作用。尤其是血管内皮细胞损伤时，VEGF能促进损伤处血管内皮细胞迅速增生。VEGF与受体特异性结合后，迅速增加细胞内Ca2＋水平，通过磷酸肌醇特异性磷酸脂酶C途径，使细胞内3－磷酸肌醇水平升高，传导细胞内信号，促进细胞增殖。同时，VEGF对损伤的内皮细胞具有保护作用，并能抑制内皮细胞的凋亡。VEGF与VEGFR－2结合后，激活PI3／Ak1、Ras／Raf／MEK／ERK等途径，提高凋亡调节蛋白Bcl－2／Bcl－XL、Survivin／XIAP、NO等的浓度，抑制内皮细胞的凋亡，促进内皮细胞存活。同时VEGF与bFGF有着协同作用，在相同条件下，两者同时刺激内皮细胞所产生的细胞数目比用单独任何一种多2～8倍。

2．增加血管的通透性 VEGF另一个重要作用是可以提高血管通透性，引起血浆蛋白外渗，外渗的纤维蛋白原可凝集形成纤维蛋白。VEGF增加血管通透性的作用非常强烈，主要作用于毛细血管后静脉和小静脉，作用迅速而短暂，不伴有肥大细胞脱颗粒作用，因此不能被抗组胺类药物所阻断。此作用主要通过Flt－1受体表现，VEGF与Flt－1结合后，受体磷酸化及产生级联后续反应，调节内皮细胞间及内皮细胞和基质间的相互作用，表现出明显的增加血管通透性作用。VEGF还能促进内皮细胞合成一氧化氮（NO）和前列环素，进而增加血管通透性。VEGF增加血管通透性也可通过增加内皮细胞的间隙来实现的。在分析内皮细胞超微结构时，发现细胞质中有些由若干囊滤泡组成的葡萄簇杆结构，称为囊滤泡器（VVO）。VVO之间、VVO与胞膜之间由3层单位膜相连，此处有由隔膜组成并能够被开启和关闭的子窗。子窗打开时，大分子物质可以从相互连接的VVO之间通过，进入周围组织间隙中。通过免疫组化证实在血管内皮细胞的基底膜和VVO中均有结合的VEGF存在。局部注射VEGF后可以观察到VVO功能增强，提示VEGF是通过VVO之间窗口开启的调节来增加血管通透性的。

3．诱导血管生成 VEGF可以诱导内皮细胞表达整合素ανβ3、ανβ5及其配体，以介导内皮细胞迁移和浸润。VEGF还可诱导内皮细胞分泌各种组织蛋白酶，主要是尿型和组织型纤维蛋白酶溶原、基质胶原酶和各种组织因子，降解细胞外基质。VEGF可能与细胞外基质中的肝素硫酸盐相互作用，在细胞外蛋白酶作用下以生物活性形式从基质中释放，降解细胞外基质，介导细胞迁移和浸润，诱导新生血管形成。

4．促淋巴细胞增殖和淋巴管生成VEGF－C是第一个被发现的淋巴管生成因子，VEGFR－3是最早发现的淋巴内皮细胞特异性标记物。VEGF－C与VEGFR－2和VEGFR－3结合后，可以诱导淋巴内皮细胞增殖、迁移，形成淋巴窦。VEGF－C的过度表达可以引起动物皮下淋巴管的异常增生。由于VEGF－D与VEGF－C在结构和功能上相似，因此可能协同VEGF－C促进淋巴细胞增殖和淋巴管形成。

5．其他作用 VEGF通过促进损伤血管内皮细胞愈合，使内皮细胞分泌促血管平滑肌细胞增生的肝素样物质减少，抑制血管平滑肌细胞由收缩型向合成型转化，间接阻止血管平滑肌的增殖和迁移，防止血管再狭窄。同时使血管内膜内皮化，血管内面光滑，间接减少血栓形成。VEGF可激活单核细胞等炎性细胞，促进其迁移，对组织炎症、组织结构和血管新生具有重要意义。VEGF可刺激血小板Ⅷ因子释放，促进血小板黏附于血管内皮细胞上，调节微血管内皮细胞的纤溶酶原激活物和纤溶酶原抑制物的表达，调节纤溶系统。

二、成纤维细胞生长因子

1974年，Grospodarowicz首先从牛垂体中分离出一种能引起Balb／c373Fb增殖的多肽物质，并命名为成纤维细胞生长因子（FGF）。FGF按其等电点的不同分为酸性FGF（aFGF）和碱性FGF（bFGF）。在组织工程中常用的是碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。bFGF是一种高效的促血管生成因子，能促进内皮细胞的增殖、分裂和迁移，促进内皮细胞形成血管腔样结构。在创伤愈合过程中，bFGF主要由Fb和血管内皮细胞表达。

（一）FGF的分子概述

FGF是由150～200个氨基酸组成的多肽，相互之间的氨基酸序列有20%～50%是相同的。其中心区域有大约120个氨基酸序列存在高度的同源性（30%～70%），迄今共鉴定出23种人或鼠FGF。在人类的FGF中，能细分出FGF7、FGF10、FGF22和FGF9、FGF16、FGF20等许多亚类。bFGF是一种阳离子多肽，有4种异构体，其编码基因具有高度保守性。

（二）FGF作用机制及其影响因素

1．FGF受体 属于酪氨酸激酶（TK）受体第四型。目前已知的FGFR有4种，分别是FGFR－1（flg）、FGFR－2（bek）、FGFR－3（flg－2）和FGFR－4（fgfr－3）。FGFR也包括胞外段、跨膜段和胞内段。

2．FGF的信号通路 FGF与存在于细胞表面的FGFRs结合，将信号传递到胞内。FGFRs都是酪氨酸激酶型受体，在与配体结合后发生二聚体化，从而激活酪氨酸激酶，通过大量释放磷脂酶C（PLC）、蛋白激酶C（PKC）、磷脂酰肌醇3－激酶系统（IP3K）和Ca2＋，向细胞内传递信号。bFGF除通过上述途径直接刺激内皮细胞增殖外，还可通过自分泌、旁分泌或胞内分泌后与FGFR结合后进入细胞核，作用于VEGF基因的上游序列，增强VEGF的转录，增加VEGF的表达，间接促进内皮细胞增殖和血管形成，此途径是bFGF直接对DNA作用，不需要通过胞内信号传导。bFGF对内皮细胞也具有保护作用，如可逆转缺氧导致的内皮细胞增殖能力下降、抑制辐射诱导的内皮细胞凋亡等。

3．胞外基质对FGF的调节作用 FGF与肝素和硫酸肝素等酸性多糖结合。这些酸性多糖不仅能提高FGF的热稳定性和对蛋白酶解的抵抗性，也能起到浓集和释放FGF等作用。最近研究显示，FGF与酸性多糖结合可提高与FGFRs的亲和力和稳定性。目前，已知23种FGF均分别作用于硫酸乙酰肝素（HSPG）链的不同特异性部位，并通过选择性形成FGFRs－FGF－HS（硫酸乙酰肝素）复合体以调控生长因子浓度及其信号传递，由此证实酸性多糖是FGF信号的必需因子。

4．FGF拮抗剂的调节 属于Wnt、Bmp和Hedgehog家族等分泌性信号分子存在分泌性拮抗剂，通过信号和拮抗剂的双调节（dual regulation）作用，精细而巧妙地控制各自的信号系统。

（三）成纤维细胞生长因子的生物学作用

FGF是肽类生长因子，能吸引、趋化炎性细胞浸润，刺激与创伤有关的细胞快速增殖、迁移，合成新的细胞间质，促进毛细血管增生和新的肉芽组织形成，加速胶原沉积。同时能诱导创伤周围组织中的Fb向创面迁移，吸引并刺激一些能分泌基质降解酶的细胞到创面，刺激成纤维细胞增殖，促进创面愈合。bFGF是一种毛细血管增殖刺激剂，通过与其靶细胞上的受体而促进新生血管的形成，包括它能促进毛细血管基底膜的降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成，小血管腔形成，bFGF促进移植血管化通过以下机制来实现的，bFGF作用于靶细胞（血管内皮细胞），因内皮细胞表面存在生长因子的特异性受体，bFGF与相应的受体结合后，通过细胞内的信号传递，启动DNA的合成和有丝分裂，从而促进血管内皮细胞的增殖和分化，促进血管化的形成。

三、肝细胞生长因子

HGF是一种多功能细胞因子，是至今发现的第一种能刺激肝细胞增生的蛋白质。后来又证明早期发现的一种由Fb分泌的“扩散因子（scatter factor，SF）”就是HGF，所以又被称为HGF／SF。在体内，HGF主要由Fb分泌，最早是在部分肝切除大鼠的组织和血小板中提取的，它是一种不耐热不耐酸的蛋白。

（一）HGF分子结构

HGF是由一条单链前体蛋白裂解生成的异质二聚体。单链HGF和异质二聚体的生物活性相当，说明活化不是必需的。活性HGF由重链和轻链组成。重链（α链）的氨基酸顺序在蛋白－蛋白相互作用中有重要作用。轻链（β链）结构与丝氨酸蛋白酶超家族的假性蛋白酶结构相似。HGF在体内广泛分布，存在于肝、肾、脾、肺、脑、胸腺、胰腺、甲状腺、涎腺等处。

（二）HGF受体及其信号传导机制

1．HGF受体 c－met是至今唯一被认识的HGF高亲和力受体，是一种由c－met原癌基因编码的跨膜蛋白，由2个亚基组成，包括细胞外结合区、跨膜区和细胞内蛋白激酶区。β亚基的细胞内区具有酪氨酸激酶活性并能转换HGF的所有效应。血管内皮细胞内存在HGF受体c－met。

2．信号传导通路 HGF与c－met结合后，引起细胞内一系列变化：促进细胞内钙离子运动，受体的酪氨酸蛋白激酶活性被激活，胞质中含有SH2结构域的效应分子如PI3激酶，磷脂酶、Src相关酪氨酸激酶、生长因子受体结合蛋白－1等与c－metβ链的多功能锚定点结合并磷酸化，引起细胞内信号转导途径的级联激活，最终导致细胞分裂或分化增加、运动能力增强、细胞连接消失等变化，进而调节内皮细胞的增殖、分化、迁移和血管生成。HGF还可通过3－磷酸肌醇激酶通路诱导VEGF和IL－8的分泌和表达，也可通过旁分泌途径诱导其他促血管生成因子（如MMP）的分泌并使其激活，间接促进内皮细胞增生和血管生成。HGF和VEGF在刺激内皮细胞增殖和促血管形成时的协同作用已得到证实，可能与HGF上调VEGF的mRNA有关。

（三）HGF的生物学效应

HGF是多效性因子，具有多种生物学活性，具有促细胞分裂剂（mitogen）、促细胞运动剂（motogen）和促形态形成剂（morphogen）等作用，还能抑制几种肿瘤细胞生长。

1．有丝分裂效应　HGF和受体结合后可刺激肝细胞、内皮细胞等多种细胞的分裂和增殖，但此种作用可被抗HGF抗体抑制。实验证明，在肝脏部分切除经过HGF基因转移的小鼠其肝脏再生恢复的时间仅需对照组动物的1／2。

2．细胞迁移效应　HGF具有化学趋向性和化学激活作用，它在促进细胞生长的同时还能促进细胞的散开移动。当培养的肾细胞中加入HGF时，可观察到细胞与细胞间的连接消失。几种上皮细胞系和内皮细胞系在培养介质中加入HGF时，可用特异的分析方法检测到细胞的移动和分裂，这种效应在不同的HGF浓度均可见到。在用化学动力法测定成纤维细胞性工程化组织促进内皮细胞迁移能力的实验中，使用抗HGF中和抗体，可将此种作用活性抑制60%，说明HGF在促内皮细胞迁移方面发挥了重要作用。

3．抑癌效应　HGF对于成熟肝细胞是DNA合成最具潜力的刺激因子，但这种作用仅限于正常肝细胞。高浓度的肝细胞生长因子能抑制某些癌和肉瘤细胞株的生长（如肝细胞癌）。HGF对肿瘤细胞的作用可能还与其他细胞因子作用有关。

四、其他促血管生成因子

（一）血小板衍生生长因子

血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）因最初从血小板中分离出而得名，组织损伤后，平滑肌细胞、毛细血管内皮细胞、单核巨噬细胞、Fb和成肌细胞增生、激活都可释放PDGF，刺激多种细胞的分裂增殖和游走。PDGF除可作为内皮细胞的促分裂剂外，在体内尚可趋化内皮细胞，是一种血管形成素，在维持血管的完整性上起一定作用。PDGF在体内对Fb、平滑细胞、内皮细胞、神经细胞皆有促生长作用，PDGF受体主要表达在活化的内皮细胞上。PDGF与受体结合后，可通过4条途径促使细胞分裂、增殖：①酪氨酸激酶途径；②启动细胞核内C－myc、C－fos和C－jun基因的转录；③引起受体自动磷酸化和在酪氨酸残基上的胞质底物的磷酸化；④增加胞内Ca2＋和Na＋／H＋的交换。其作用之一是在创伤愈合及组织修复中促进支持血管形成的组织间质的形成。

（二）转化生长因子－β

转化生长因子（TGF－β）是内皮细胞分化的重要调节因子。它能通过活化成纤维细胞生长因子来促进成纤维细胞增生，后者可分泌促血管生成因子，同时，TGF－β可以促进内皮细胞和基质的黏附，有利于血管形成。TGF－β对多种细胞类型有生长抑制作用，其对内皮细胞具有抑制和促进的双重作用，与TGF－β受体表达的类型有关。TGF－β1与VEGF有协同作用，可共同促进内皮细胞增殖。

（三）细胞因子（cytokines）

主要包括IL－1、IL－6和IL－8。细胞因子以网络的形式分布并发挥着各自的作用。IL－1是由巨噬细胞分泌的多肽类生长因子，能促进炎性蛋白和炎性介质的释放，还可诱导内皮细胞表达内皮黏附分子；IL－6主要作为前炎症物质，在激活宿主局部防御机制的同时，也直接影响纤维细胞与内皮细胞的生长。Cole等采用酶联免疫吸附试验（enzyme－linked immunosorbert assay，ELISA）测定了鼠角膜损伤后IL－6的含量，原位杂交检测了IL－6的mRNA的表达；TNF能刺激成纤维细胞的增殖及胶原合成，并能刺激血管再生。IL－8在兔角膜实验中被证实能诱导内皮细胞增生。