培养用具的消毒和灭菌

在组织细胞培养过程中，组织培养用具的污染往往是失败的主要原因之一。保证组织培养用具的无菌，是实验准备中极为重要的环节。尽管组织培养用具趋向于一次性使用后弃之不用的方向发展，但目前在我国多数实验室因为条件所限尚未普遍采用，主要仍使用可反复使用的玻璃器皿等，如何正确地对试验器皿进行消毒和灭菌，仍然是我们目前必须掌握的一项技能。实验物品材质的不同，所采用的消毒和灭菌的方法也有区别，常见的消毒和灭菌方法分为3类：物理消毒灭菌法、化学灭菌法和抗生素灭菌法。

一、物理方法

物理消毒灭菌法主要包括紫外线消毒、干热消毒、湿热（高压蒸汽）消毒、过滤除菌、射线消毒及超声波消毒等。

（一）紫外线消毒

紫外线是非电离辐射，波长为136～400nm，以波长265～266nm的杀菌为最强。微生物细胞中的核酸碱基对紫外线吸收能力特强，辐射后引起核酸的突变，从而抑制DNA的复制而致死；同时，空气中的一部分氧在紫外线照射下产生臭氧，也具有很强的杀菌作用。另外，紫外线照射微生物细胞后，在有氧的情况下，产生光化学氧化反应，生成过氧化氢（H2O2），能发生强烈氧化作用，引起细胞死亡，从而达到杀菌目的。

紫外线直接照射消毒是目前各实验室常用的方法之一，主要用于实验室房间里的空气、操作台表面和一些不能使用其他方法进行消毒的培养器具（如塑料培养皿、塑料培养板等）。这种消毒法要求紫外线灯在房间内安装不能高于2．5m，使每平方厘米有0．06μW能量的照射，这样才能产生有效的消毒作用。由于各种细菌对紫外线的敏感性不同，所用照射时间和剂量也不同，经一定时间的照射后，可以消灭空气中大部分细菌。

这种消毒方法的缺点是会产生臭氧，污染空气，对身体有害。同时，射线照射不到的部位就不产生消毒效果，故消毒时，物品不宜相互遮挡。有些实验人员习惯于边照射边进行实验操作，这种习惯不好，一是紫外线对细胞、试剂和培养溶液都有不良影响，二是对人的皮肤和眼睛也有伤害。

（二）热力消毒

利用高温杀死微生物的方法，称为热力消毒（灭菌）。微生物组成的最重要成分是蛋白质、核酸等，遇高温时会引起蛋白质和核酸不可逆的变性或凝固，使细胞失去生理功能，停止生长发育，直至生化反应停止而终止生命。此外，高温尚可破坏细胞的其他组成，或者使细胞膜受热溶解而形成极大的孔，导致细胞内容物漏出而引起死亡，从而达到高温灭菌的效果。

热力消毒（灭菌）经常使用2个杀菌指数，即热死温度和热死速度。前者指在10min内可以杀死细菌悬液中所有细胞的温度，后者指在一定温度下，杀死所有细胞所需的时间。在同样温度条件下，热死温度高的微生物，其热死速度慢，热死温度低的微生物，其热死速度快。提高灭菌温度，可以加快热死速度。因此，可以通过提高灭菌温度来缩短灭菌时间，或延长灭菌时间以降低灭菌温度。

热力灭菌经济有效，简便易行，是最普遍采用的方法，它可以分为干热消毒（灭菌）和湿热消毒（灭菌）两种。

1．干热消毒（灭菌） 干热是指相对湿度在20%以下的高热。一般繁殖体在干热80～100℃中经1h可以杀死，芽胞需160～170℃经2h方可杀死。干热消毒主要用于消毒高温不致损坏的器具（如玻璃器皿）等，一般常在烤箱中进行。干热消毒最为简便，消毒后的器皿干燥，易于贮存。缺点是干热传导慢，可能有冷空气存留于烤箱内，因此要用较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的。

消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果、损坏玻璃器皿或发生意外事故。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒方法。

2．湿热消毒（灭菌） 湿热消毒是一种很有效的消毒方法，一般采用高压蒸汽灭菌器进行。布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些不因高温破坏其成分的溶液等都可用本方法消毒灭菌。湿热时的蒸汽能较快穿透，热传导效果好，故比干热更有效。为了保证消毒的效果，消毒物品不应装得太满，以便消毒器内气体流通；同时，导气管要伸至罐底并防止堵塞。在加热升压之前，先要打开排气阀门，排出残留容器内的冷空气，冷空气排出后，关闭排气阀门；继而开始升压，当达到所需要的压力时开始计时，同时注意调节加热火焰大小，使压力稳定在所需数值。消毒过程中消毒者严禁离开岗位，并经常检查压力是否保持恒定，如有偏离，应及时调整。一般压力消毒罐虽都装有安全阀，但还是以不发生过压为宜，以免影响消毒物品性状或发生其他意外。

根据不同的物品选择不同的压力和时间，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是压力100kPa（121℃），持续15～30min。培养用液和橡胶类的物品压力70kPa（115℃），维持10min。消毒完毕后注意要先打开阀门放气，再打开消毒器械的盖，防止发生意外。培养用液不能放在密闭的容器中高压消毒（可通过在瓶塞上插一针头解决），谨防爆炸。消毒好的物品（除了液体）应立即放到60～70℃烤箱内烘干，否则，潮湿的包装表面易被微生物污染。

3．其他 如煮沸消毒和火焰消毒。

（1）煮沸消毒法：常用于注射器和某些用具的快速消毒，优点在于简便迅速。缺点是湿度大，消毒后不适于长时间保存，同时金属物品消毒后易生锈。

（2）火焰消毒：是一种简单、迅速、彻底的消毒方法，因其对物品的破坏性大，故应用范围有限。一些耐高温的器械（如金属、搪瓷类），在急用或无条件用其他方法消毒时可采用此法。将器械放在火焰上烧灼1～2min。若为搪瓷容器，可倒少量95%乙醇，慢慢转动容器，使乙醇分布均匀，点火燃烧至熄灭1～2min。采集做细菌培养的标本或打开培养瓶时，在留取标本或打开瓶口前后（即启盖后，闭盖前）都应将试管（瓶）口和盖子置于火焰上烧灼，且来回旋转2～3次。

燃烧时要注意安全，须远离易燃易爆物品，如氧气、汽油、乙醚等。燃烧过程不得添加乙醇，以免引起火焰上窜而致灼伤或火灾。锐利刀剪为保护刀锋，不宜用火焰消毒法。

（三）过滤除菌

目前组织细胞培养使用的液体中大部分因在高温下发生变性、失去功能而不能采用加热消毒方法进行灭菌处理，如血清、人工合成培养液、酶溶液及一些含有蛋白质具有生物活性的液体等。对这些可采用过滤方法去除细菌等微生物。常见的滤器有Zeiss滤器、微孔滤膜滤器及各种不同规格的一次性滤器。一次性滤器采用灭菌包装，使用方便，但由于价格原因目前尚难以广泛应用。其他还有玻璃滤器，因使用后易残存剩余物，清除过程繁琐，目前已少用，在这里不做过多阐述。下面主要介绍一下常用的Zeiss滤器和微孔滤膜滤器。

Zeiss滤器为不锈钢金属结构，中间夹有一层纤维性滤板或滤膜，老式石棉滤板有一定厚度，可承受一定压力，是过滤血清等黏稠液体的理想滤器。滤器分为抽滤式和加压式。抽滤式滤器通过抽气形成负压以过滤液体，其效率不如加压式。由于抽气形成负压吸引，操作中要注意避免液体倒流使实验材料被污染。加压式滤器的容器为密闭式，加入待过滤的液体后，通以气体（如CO2、N2和 O2等）形成压力使液体滤过，使用中要注意压力不能太大（不超过0．2kg／cm2）。消毒时，旋钮不宜扭得太紧，凡是与空气接触的部位均须用纸或布包装好，消毒后在无菌环境中立即将旋钮扭紧。

Zeiss滤器的清洗比玻璃滤器简单，滤板或者滤膜在使用后可弃去，滤器先用自来水进行初步冲洗后用洗涤剂刷洗干净，然后自来水冲净，最后用蒸馏水冲洗后晾干包装。若以石棉作为滤板，在使用过程中可能导致混入杂质，故已较少使用，目前多采用由混合纤维素制成的微孔滤膜，即微孔滤膜滤器。

微孔滤膜滤器结构与Zeiss滤器基本相同，也分加压式和抽滤式两种，加压式效果更好。因其过滤速度快，除菌效果好，适用于包括血清在内的多种培养液的过滤除菌，已在众多实验室广泛使用。

除菌过程中滤膜的选择是效果好坏的关键。滤膜有0．60μm、0．45μm、0．22μm等几种规格，常用孔径为0．22μm。由于滤膜薄，承受压力有限，力量不能过大、过猛，以免造成滤膜破裂，同时要注意滤膜的正反面，正面（光滑面）向上。每次过滤完毕须打开滤器，核实滤膜是否有移位和破裂，以保证滤过效果。在滤过液体量较少的情况下，可直接将小滤器安装在注射器上，滤过时把滤过液装入注射器针管内，压出过滤液接入无菌容器中即可达到除菌目的。

微孔滤膜滤器的清洗与Zeiss滤器相同，滤膜为一次性，使用后即丢弃。

（四）射线消毒

利用60Co、X射线和加速器等产生的辐射来消毒灭菌，这种方法适用于消毒量大和不宜做高压和滤过的培养用品，如塑料等。

（五）超声波消毒

利用频率在20～200kHz的声波作用，使细菌细胞机械破裂和原生质迅速游离，达到消毒目的。如超声洗手器，用于手的消毒。超声洗涤机，用于注射器的清洁和初步的消毒处理。

二、化学消毒法

利用化学药物渗透细菌的体内，使菌体蛋白凝固变性，干扰细菌酶的活性，抑制细菌代谢和生长或损害细胞膜的结构，改变其渗透性，破坏其生理功能等，从而起到消毒灭菌作用。所用的药物称化学消毒药。有的药物杀灭微生物的能力较强，可以达到灭菌，又称为灭菌剂。

化学制剂，包括来苏尔、苯扎溴铵、过氧乙酸和75%乙醇溶液等。化学消毒法主要用于消毒那些无法用其他方法进行消毒的物品，如操作者的皮肤、操作台表面即无菌室内的桌椅、墙壁和空气等。

（一）化学消毒灭菌药的使用原则

采用化学灭菌的方法应遵循下列原则：①根据物品的性能及微生物体的特性，选择合适的消毒药；②严格掌握消毒药的有效浓度、消毒时间和使用方法；③需消毒的物品应洗净擦干，浸泡时打开轴节，将物品浸没于溶液里；④消毒药应定期更换，若为挥发性制剂应加盖并定期测定比重，及时调整浓度；⑤浸泡过的物品，使用前需用无菌等渗盐水冲洗，以免消毒药刺激人体组织。

（二）常用化学消毒灭菌的方法

1．浸泡法　选用杀菌谱广、腐蚀性弱、水溶性强的消毒药，将物品浸没于消毒药内，在标准的浓度和时间内，达到消毒灭菌目的。

2．擦拭法　选用易溶于水、穿透性强的消毒药，擦拭物品表面，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。

3．熏蒸法　加热或加入氧化剂，使消毒药呈气体，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。适用于室内物品及空气消毒或精密贵重仪器和不能蒸、煮、浸泡的物品。

4．喷雾法　借助普通喷雾器或气溶胶喷雾器，使消毒药产生微粒气雾弥散在空间，进行空气和物品表面的消毒。

5．环氧乙烷气体密闭消毒法　将环氧乙烷气体置于密闭容器内，在标准的浓度、湿度和时间内达到消毒灭菌目的。

（三）消毒药的性质与消毒水平

1．高效消毒药　杀菌谱广、消毒方法多样，如环氧乙烷、过氧乙酸、甲醛、戊二醛、含氯消毒药（含氯石灰、“三合一”、次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠等）。高效消毒药性质不稳定，需现用现配。

2．中效消毒药　其特点是溶解度好、性质稳定、能长期贮存，但不能做灭菌剂。如碘仿、碘酒、乙醇、煤酚皂、高锰酸钾等。

3．低效消毒药　性质稳定、能长期贮存，无异味，无刺激性，但杀菌谱窄，对芽胞只有抑制作用。如季铵盐类（苯扎溴铵、度米芬、“消毒净”）、氯己定等。

4．消毒药浓度稀释配制　消毒药原液和加工剂型一般浓度较高，在实际应用中，必须根据消毒的对象和目的加以稀释，配制成适宜浓度使用，才能收到良好的消毒灭菌效果。

三、抗生素消毒

在组织培养工作中也常常用到抗生素消毒。抗生素消毒，确切的说是抗生素灭菌，主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。利用抗生素灭菌或创造一个无菌环境，也是实验室工作中非常重要的灭菌手段。许多药品可使菌体蛋白质变性，有的可阻碍微生物的某一代谢环节。因此，抗生素可起到杀菌作用或抑菌作用。

抗生素种类很多，根据其不同的抗菌谱针对性地加以选用。抗生素消毒主要用于培养液的消毒。常用的抗生素为青霉素和链霉素。值得注意的是不能完全依赖于抗生素来实现消毒灭菌。