细胞培养的基本操作技术和要求

组织培养技术发展至今，从培养对象来说，人体内的组织和细胞几乎无一不能培养。但由于细胞分化所导致的组织和细胞相互差异，各种组织细胞均有着不同的生物学个性，这反映在对体外培养条件上各有不同的要求，但是细胞培养也存在着共性和共同的需求条件，其基本原则是保证无微生物污染和不受其他有毒有害因素的影响。组织细胞培养的具体工作有器皿清洁、试剂和培养液的配制，分离培养细胞、细胞传代、细胞的冻存、复苏与运输等。以上过程均需坚持无菌原则。本章着重介绍组织细胞培养的基本要求和操作要领，只要熟悉了这些基本内容，并以其为基础，其他不难掌握。

一、基本要求

（一）无菌操作

由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故操作时应做到严格无菌。无菌是决定培养成败的关键。

（二）培养前的准备

培养前的准备工作必须做好，尤其对于初学者，应制订分门别类的操作卡片，各卡片记录所需的器材和物品名称、要求和数量等，这样有利于统一消毒，避免因操作开始后，因物品不全在往返拿取时增加污染机会。

1．操作台消毒　多用紫外线灯灭菌，效果好，用30W紫外灯，操作室根据面积大小消毒30～50min。净化工作台亦需设紫外线灯，主要用于消毒台面和台面上的用品，但对台面流动的空气无意义。紫外线灯只有直接杀菌的作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消毒效果。

2．洗手和着装　原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。一般用75%的乙醇擦洗消毒较方便，必要时亦可用0．2%苯扎溴铵洗涤消毒。在净化工作台操作时，需戴口罩和工作帽，着一般工作服，但无菌室内工作需着消毒衣帽。

3．火焰消毒 无菌环境中进行培养或其他无菌操作时，首先要点燃用不含杂质的95%乙醇的酒精灯。之后的一切操作，如开启和封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼。但是，需注意的是金属器械不能在火焰中烧过长时间，且烧过的金属器械要待冷却后才能夹取组织，以免损伤组织。已吸取过培养液的吸管烧后不能再用，残留的培养液被烧焦后形成碳膜，如再用会将有害物质带入培养液。

（三）培养操作

进行培养操作时，要严格无菌操作，动作要准确敏捷，不能用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部或更换。工作台上的东西应摆放合理，工作要有一定的顺序性，培养瓶在开瓶以后，应保持45°或平放，开口向上可增加落菌机会。吸取不同培养用液时应分别使用吸管，工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免增加污染机会。

（四）实验室设计

实验室应分为无菌室、准备室和洗刷消毒室。无菌室包括操作间和缓冲间。缓冲间能保护无菌间的无菌环境，可兼有更换无菌衣帽和进行一些简单操作（如离心等）的功能。经常消毒是保持无菌状态所必需的，通常在使用前紫外线照射（1～2h），每周甲醛、乳酸或过氧乙酸熏蒸（2h）和每个月本扎溴铵擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。使用无菌室时应按以下程序：①紫外线无菌室消毒，准备实验材料和器具；②手部消毒，穿戴无菌衣帽和口罩；③关闭杀菌灯，通过一定路线拿入必要物品；④手部再次消毒后，进行实验；⑤完成实验，将用完物品移出室外。

无菌室中一般在超净工作台上进行细胞培养，外界空气通过过滤器从上面、侧面或正面流入操作箱内，形成气流屏障，以保持台面无菌。工作程序为：①接通电源，开紫外线灯进行消毒15～30min；②打开操作窗，消毒手部后进行操作；③操作完毕后清理超净台面，关闭操作窗，切断电源。

二、基本操作技术

（一）器皿清洗

除了一些一次性无菌实验用品可用后即弃，其他的器材需要清洗后消毒灭菌，再重复使用。见本篇第25章第一节。

（二）消毒和灭菌

污染是导致细胞培养失败的主要原因，通过消毒灭菌和无菌操作技术可以防止培养物污染。具体方法见本篇第25章第二节。

（三）取材

理论上，幼体个体组织比年老个体组织易于培养，分化程度低的组织比分化程度高的组织容易生长，肿瘤组织比正常组织容易培养。在无特殊要求时，取易于培养的组织进行培养，成功率高。取材之后立即培养最好，如不能立即培养，应把组织切成1cm× 1cm的小块，置于培养液中，4℃保存，存放时间不宜超过24h，从体内取材的组织，应严格保持无菌。为减少污染，可能污染的组织培养前，可用含青霉素、链霉素的BSS液，漂洗数次后再培养。

（四）分离

从体内取出的组织均由众多结合紧密的细胞和纤维成分组成，体积大于1mm3的组织块置于培养瓶后，组织块中心的细胞因为营养有限而代谢不良。为获得多量的生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，能达到单细胞水平更好，分散细胞的方法分机械法和化学法。根据组织种类和培养要求，宜采用不同方法。

1．离心分离法　如培养物为细胞悬液，如血液、羊水、腹水、胸腔积液等时，可采用离心分离法，一般用低速离心每分钟500～1 000转，离心5～10min即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，但也不可速度过大和时间过长，以免造成易压挤导致细胞死亡。

2．机械分散法　主要用剪切法。一般将组织剪切成1mm3大小，再加Hanks液后，用吸管反复吸吹冲打，低速离心，去上清，余下组织进行培养。某些软组织，如脑、胚胎等，可将组织放入注射器压挤法或将组织置于不锈钢网中压取法。机械法较简单易行，但对组织可能有一定损伤，较适用于软组织。

3．消化分离法　是在把组织剪切成较小的体积的基础上，应用生化和化学的手段进一步分散组织，这种方法较为常用，最后被处理的组织分散成细胞团或单个细胞，加入培养液制成细胞悬液，接种入培养皿中后容易生长和繁殖。根据组织不同，消化手段也不同。

（1）胰蛋白酶消化法：应用较广，胰酶主要包括胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶。胰蛋白酶消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。胰蛋白酶的消化作用，与pH、温度、组织大小、组织硬度及胰蛋白酶的浓度都有关系。胰蛋白酶的浓度在0．01%～0．5%范围，常用0．25%浓度，37℃温度，消化5mm3大小的胚胎类软组织，20～30min即可。组织块大或成体较硬组织，可延长至数小时。当置于4℃时，仍有缓慢消化作用，消化时间可延长12～20h。浓度过大或消化时间过长，细胞可被消化掉；但消化不充分也达不到分散细胞的目的。pH 8～9较好。因此，在新条件下使用胰蛋白酶时，可做些探试，以确定最佳参数。其程序为：①剪切。把组织剪切成3mm×3mm×3mm的小块。②加液。把组织置于比其量多30～50倍的0．25%胰蛋白酶中（预加温至37℃）。③消化。37℃温箱中消化30～60min，每隔5～10min摇动一次或者置电磁搅拌器台上消化。④消化完毕，倒入离心管中，每分钟800转离心6～8min后吸除上清液。⑤用Hanks液漂洗2～3min，离心去上清，共两次。⑥每分钟800转离心5min后去上清，加入一定量的营养液，通过100μm孔径的筛网过滤，收集细胞悬液，用吸管吸取1滴细胞悬液滴于载物片上观察，如细胞分散、形态完整，可用于培养。

（2）胶原酶消化法：胶原酶是一种从细菌中提取的酶，对胶原有很强的消化作用。胶原酶对细胞间质有较好的消化作用，而上皮细胞对其的耐受性好，所以胶原酶能使上皮细胞和胶原脱离而不受伤害，效果好。常用剂量为最终浓度200U／ml或0．1～0．3μg／ml。此酶消化作用缓和，且无须机械振荡，消化过程为：①漂洗干净的组织剪成1～5mm3的小块，移入青霉素小瓶中；②加入适量0．2%胶原酶溶液；③置36．5℃中4～48h，如消化缓慢可延长至3～5d，期间不必摇动；④如见组织已经变软，散于瓶底，振荡后可散成细胞团和单个细胞；⑤低速离心培养液5min，去上清，重悬于BSS中，再低速离心5min，去上清；⑥加入新培养液制备成细胞悬液，可接种进行培养。另外，胰蛋白酶和胶原酶可以协同应用，浓度为每毫升含胰蛋白酶0．1mg、胶原酶0．25mg。两酶的差别见表26－1。

表26－1　胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别

除胰蛋白酶和胶原酶外，其他有消化作用的酶还很多，如链霉蛋白酶、透明质酸酶、黏蛋白酶等，需根据不同需求选用。

（3）EDTA消化法：EDTA（二乙烯四乙酸二钠）是一种非酶性消化物，常用不含Ca2＋和Mg2＋的BSS配成0．02%的工作液。关于EDTA的作用机制，一些学者有这样的观点。一些组织，尤其是上皮组织，在生存中需要Ca2＋和Mg2＋才能维持组织的完整性。EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子，形成螯合物，能促进细胞相互分离。EDTA作用比胰蛋白酶缓和，很少用于单独消化新鲜组织（传代细胞可单用），如与胰蛋白酶按不同比例相混合并用，消化作用更好。EDTA最适消化传代细胞，也多与胰蛋白酶混合使用（1∶1或2∶1）。用EDTA和胰蛋白酶混合消化法传代的过程如下：①吸出培养液，注入EDTA（0．02%）和胰蛋白酶（0．25%）混合液（1∶1），置37℃或室温中作用3～5min。在镜下监视细胞状态，当见到细胞质回缩，胞体趋于变圆，细胞相互之间缝隙变大，立即终止消化。②吸出消化液，注入适量Hanks液轻轻洗1或2次，不要用力过猛，以免把附着不牢的细胞冲掉。③吸出Hanks液，加入适量培养液后，用吸管吸、吹培养液，反复轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之脱落入培养液中形成细胞悬液。

（雷　霞）

参 考 文 献

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