一、细菌、霉菌污染的检测
细菌和霉菌的污染相对容易发现。方法有肉眼直接观察法、显微镜观察法和培养检查法。
（一）肉眼观察
细菌、霉菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48h内可明显观察到。如培养液变混浊，培养基颜色改变（变黄）或略加振荡有很多漂浮物漂起。
（二）镜下观察
在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。高倍镜下运动的黑点或者是像鱼群穿梭游动的杆状物，也是细菌污染的征兆。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为霉菌污染。
（三）培养观察
采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。硫乙醇酸盐培养基常用来判断需氧菌和厌氧菌污染，改良马丁培养基和霉菌培养基常用来判断霉菌污染。若出现阳性菌落即有污染存在。
二、支原体污染的检测
在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应该怀疑支原体污染。支原体污染难以观察特殊的外观变化，培养液也不混浊。故常规的支原体检测是非常必要的。可利用一系列直接或间接的方法检测支原体。但由于支原体种类的多样性，目前还没有一种方便、广谱、特异性高、准确的检测方法。因此，考虑到不同检测方法的灵敏度及局限性，应该利用不同的技术，多次检测，以弥补各种检测技术的缺陷，增加检测结果的可信度。其中，DNA荧光染色法和直接培养法相结合是支原体检测的金标准。
（一）相差显微镜观察
将细胞接种于事先放置于培养板内的盖玻片上，24h后用无菌镊子从培养瓶中取出，细胞面向上放置于载玻片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；也可直接取少许培养液滴在载玻片上，再盖上盖片观察。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物（如线粒体等）相区别。
（二）地衣红染色观察
取盖玻片或培养液，用新鲜配制的0．5%枸橼酸溶液处理盖玻片上的细胞。新配制的Carnoy液固定2次，每次10min，取出盖片晾干。用培养液时，先吸取1ml，每分钟500～800转离心5min后去除上清，留0．2ml，将0．5%枸橼酸溶液加入其中，静置10min，加入Carnoy液固定，离心弃上清固定液，余0．2ml沉淀物，制成2～3张涂片。然后，用2%醋酸地衣红（地衣红2g，冰醋酸60ml，加蒸馏水至100ml）染5min。纯乙醇过3次，每次1min，封入树胶中。镜下观察见支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞之间。
（三）荧光染色法观察
用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为：细胞（常用Vero细胞）融合前取出盖玻片，用不含酚红的Hanks液漂洗，1∶3醋酸钾固定10min，再用生理盐水漂洗后置于50μg／ml的Hoechst33258（生理盐水配制）中染色10min，蒸馏水漂洗1～2min，向细胞面滴加数滴pH 5．5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，离心弃上清后加入1∶3醋酸甲醇固定10min，再用生理盐水漂洗后去上清液，之后Hoechst33258染色10min，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加3～5滴pH5．5磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面（图29－1）。
图29－1 支原体DNA染色法（×1 000）
上．阴性对照；中．阳性对照；下．阳性样品
（四）电镜检测
若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72h，细胞接近融合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。呈煎蛋样外观。
（五）培养检测
将2．5×109个／L细胞悬液5ml加入45ml支原体肉汤培养基，培养14d后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0．5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3d观察有无“荷包蛋”样菌落出现。
（六）PCR法检测
利用特殊专一性的引物，经PCR反应来复制支原体DNA。所用的引物来自支原体的保守16S－23S的rRNA序列，由于这段序列随支原体种类不同而不同，因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来做检测及鉴定。优点是灵敏及快速，可检测到不易培养的支原体，不必培养支原体做阴阳性对照，避免可能带来的污染。缺点是容易带来假阳性结果，仅能作为参考。
（七）支原体检测试剂盒
如美国ICN公司的产品，可在一定程度上帮助尽快发现支原体的污染。
三、病毒污染的检测
可以使用许多体内或体外实验，包括大鼠或小鼠的接种、反转录酶分析、凝血实验、红细胞吸附实验、PCR、电镜等方法，来判定有无病毒污染。
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