显微镜的应用

由于活细胞无色透明，当光波通过时，颜色和亮度改变不大，反差很小，所以用一般光学显微镜观察活细胞时难以看清楚细胞的基本结构。相差显微镜则能很好地解决这一问题，它是利用细胞内各种结构密度不同而导致光折射率有差异的原理，使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明暗差），这样无色透明的物体在镜下观察时其结构形成显著反差，能够清晰成像。因此，相差显微镜特别适合于：①观察不染色的活细胞标本，或是染色所不能显示的微细结构；②观察活细胞的活动特性及活细胞的生理及病理变化。

使用相差显微镜观察时对光路要求高，首先是光轴要对正，其次是视野照明光度应均匀，其光轴对正（合轴）的方法是：①先调好相位板，使聚光器相位板号与物镜放大倍数相一致；②抽出目镜，换上中心望远镜，对准中心望远镜的焦点，便可见到2个光环，即相板上的圆环和环状光阑的亮环，调整聚光器上的调节钮，使视野中2个大小一样的光环完全重叠；③再换上原目镜，即成相差图像；当更换不同倍数物镜时需按上述过程重新调节。有时可出现2个圆环大小不一致的情况，若环状光阑的亮环比相板的圆环小而位于内侧时，应降低聚光器；反之，应升高聚光器致最大限度。如果仍不能纠正，可能是载玻片过厚，应予更换适当厚度的载玻片。

视野照明度应均匀，其调节方法是：在调整显微镜的光轴基础上，先将光圈关至最小，使用低倍镜，让光落于视野中央，如存在偏斜现象，可转动聚光器的调节钮来调整。然后打开光圈，并调节反射光镜使视野照明均匀，使被检物达到最大限度的反差图像。

使用时有以下基本要求：①要求培养瓶和皿底部平坦、质地均匀、透光度好，塑料培养瓶完全满足这些要求，最为理想，玻璃瓶底面凹凸不平，相差观察效果差，摄影更差；②观察和摄像前要擦净培养瓶表面，以免污迹残留影响透光度；③调整照明光的照明度，令视野照明均匀，对正光轴是显微摄影的重要条件，不可忽视；④摄影时如无自控摄像装置，应把放大倍数、光圈大小、照明强度和曝光时间等条件逐一记录下来，做一组不同曝光时间的实验，显影后选最佳组合，作为以后再拍摄时的标准参数；目前采用数码相机或CCD摄影头采集图像更为方便；⑤相位膜有推迟直射光和衍射相位的作用，利用相位膜推迟直射光的明负反差，如推迟衍射光的暗正反差。一般相板多为吸收（推迟）直射光的类型，通常使用推迟波长的相位膜，如明暗反差过强，可使用推迟波长的相位膜，反之亦然。

倒置相差显微镜是细胞培养观察最直接的重要工具。因此，正确使用倒置显微镜是细胞培养研究的基本技能。倒置显微镜的光源和聚光器位于载物台上方，物镜在载物台下方，载物台上可以放置培养瓶／皿，便于观察贴壁生长的活细胞，相对普通光学显微镜其光路正好颠倒过来，故称倒置显微镜。而倒置相差显微镜主要是在倒置显微镜上配有相差长焦距聚光器和相差物镜而成，还可以装配暗视野聚光器、荧光显微镜光源和滤片，以进行各种实验观察。这种显微镜的载物台除可以放置培养瓶皿外，还可装配恒温调节器、各种显微操作器等，如再配置照相机、电视机或电影摄影机，就可以记录和连续观察活细胞的系列变化，拍成连续的照片和电影片等，使观察更为直观和形象。因此，每个实验室根据自己的研究要求，选购合适的相差显微镜。