大规模细胞培养方式和生物反应器

细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。随着人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品需求的猛增，传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远不能满足这一需求，随着细胞培养原理和方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。然而，由于组织工程需要的是细胞本身，且往往是成体细胞，因此，大规模生产细胞还存在技术上的困难。

一、大规模培养

细胞大规模培养技术是指在人工条件下，在细胞生物反应器中高密度大量的培养细胞以生产生物制品的技术。在放大的过程中，需解决的问题有培养基的优化、细胞生长限制因素的确定及消除、产物表达的有效控制、污染的控制、硬件和过程参数的优化、产物或细胞本身的有效回收。目前，可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、CHO（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK－21（仓鼠肾细胞）、Vero细胞（非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的Fb）等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。

总的说来，用于生物制品生产的细胞培养规模放大步骤有5个阶段，即筛选细胞系确定培养条件产物表达的优化为放大修正条件放大生产。第一阶段是筛选和开发高效表达目的产物的细胞系；常在细胞培养实验室进行，在细胞培养瓶和培养板中进行培养，这一阶段通常涉及DNA重组和细胞融合技术，以期获得一个具有较高生长速率、较强的抗诱变性能、较高的专一表达水平的细胞株。第二阶段是在方瓶、转瓶或搅拌瓶中简单放大，确定该细胞系对营养物质和环境的要求，一般在细胞培养实验室中完成。放大的过程从第三阶段开始，这一阶段细胞培养转入生物反应器中进行；最理想的是采用小型化的台式反应器，其工作体积为1～5L。对细胞的营养物质要求和环境条件参数进行验证和修正，确定最佳的操作方式。第四阶段在中试规模的基础上进一步根据生产的实际条件和可能性，确定过程的控制方案，根据细胞株的实际情况寻求过程的优化方案，对培养的环境做进一步的调整；这一阶段是把实验室的结果引向生产水平过渡中所必需的，其中包含许多在转入生产规模时必须解决的工程问题；需在中试车间或生物工程实验室中完成。第五阶段是扩大到生产规模，在生产车间和中试车间完成，所用的反应器是规模生产级反应器，但还必须与中试工程密切结合，在生产规模中还须解决的问题可以和中试的实验相结合，最终完成由实验室研究转入规模化生产的研究过程。

虽然动物细胞大规模培养方法种类繁多，但归纳起来有三大类，包括单层静置贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等3种形式。可以根据细胞类型、实际应用和生产实践中的具体需要来选择不同的培养方法。在这3种生产方式中，又可采用不同的生物反应器来生产细胞。

（一）单层静置贴壁培养

指细胞贴附在一定的固相表面进行培养，并不断的生长繁殖而形成单层细胞。几乎所有的细胞（包括原代、传代）均能进行培养。其优点是在显微镜下可直接观察到细胞的形态，有利于研究各种影响因素对细胞形态学变化的影响；容易更换培养基，细胞清洗方便，不需离心；便于采用灌注培养，无需采用细胞过滤系统；当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效地表达一种产品；同一装备可使用不同的培养液／细胞比例，在实验期间这一比例较容易调整。

单层培养与悬浮培养相比也存在以下缺点：如占用的空间大；细胞取样、计数较困难；传代、扩大培养比较困难，生产规模受限制；在测定和控制pH、O2及细胞完全同质性方面是比较困难的；因所用培养瓶（管）的瓶（管）口多，传代换液需开口操作，容易发生污染。

单层培养包括转管和转瓶培养、旋转圆柱培养等。转管和转瓶培养是将试管或转瓶固定在支架上或放在一排转轴之间，使转瓶随着转轴以每小时6～12转缓慢转动。经转动使培养液流动，利于细胞吸收养分，带走代谢产物，并使细胞有机会接触气体，有利于细胞呼吸和生长繁殖。旋转圆柱培养是一种小玻璃管束平行排列包裹在圆瓶内，由一个多歧管与各束管连通制成一个大转瓶，此装置因体积大，以每小时4～6转的转速沿纵轴旋转。

（二）悬浮培养

指细胞在外力作用下，一直处于自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养。目前对造血细胞、淋巴细胞、白血病细胞、类淋巴细胞最适合。其优点有可连续扩大生产量，有利于细胞可连续扩大生产量。有利于细胞与培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件（温度、pH、氧分压和CO2等）。培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究。易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会。可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期。

悬浮培养方法包括静置悬浮培养法、翻滚培养法、旋转培养法、旋摇培养法、电磁悬搅培养法、振动器培养法、滋养器装置、发酵罐培养等。无血清悬浮培养是用已知人或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养新的研究方向。

（三）固定化培养

将细胞限制或定位于特定空间位置（不只是贴附在一个表面面积上）的培养技术称为细胞固定化培养。上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，易于更换培养基、易于细胞洗涤，易于进行灌注培养，细胞抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易与产物分开，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子／共价交联法、包埋法、微囊法等。其缺点在于细胞生产规模受限，只能用于一次性产品制备，难以达到工业化生产规模。

固定化培养的方式有多层培养（包括多层繁殖器、多层托盘或装量、Opticell培养系统、塑料软片培养系统和Heli－cel薄片卷带式培养）、微载体培养、中空纤维管培养、玻璃珠床培养和包被细胞培养等方法。

二、生物反应器

20世纪70年代以来，动物细胞培养用生物反应器有了很大的发展，其种类越来越多，规模越来越大，根据生物反应器的用途不同，有悬浮用生物反应器、贴壁培养用生物反应器和包埋培养用生物反应器等。但是，与微生物和植物细胞不同，动物细胞的外层是质膜，脆性大，在反应器中务必减少剪切力。目前用于细胞培养的生物反应器，种类上大致有搅拌式生物反应器、灌注生物反应器、中空纤维管生物反应器、旋转生物反应器和流化床生物反应器等。

（一）搅拌罐反应器

搅拌罐反应器是结构相对简单的反应器，一般是把种植了细胞的支架悬吊在瓶塞上，使之浸没在磁力搅拌的培养液中。细胞培养过程中要求搅拌器转动时产生的剪切力小，混合性能好，同时通气应尽量减少对细胞的损伤程度，又能达到充足供氧的目的。根据这个要求，目前已开发了不同形式的搅拌器，如笼式通气搅拌器、双层笼式通气搅拌器、桨式和海船式搅拌器等。笼式通气搅拌器是由中空的搅拌轴、消泡腔、中心管、3个导流筒、通气腔及单层丝网等部分构成。当3个导流筒随搅拌同步转动时，由于离心力作用，搅拌器中心管产生负压，迫使培养液流入中心管内，沿管壁螺旋上升，再从3个导流筒排出，绕搅拌器外缘螺旋下降，使培养液反复循环，达到混合均匀的目的。双层笼式搅拌器是在笼式通气搅拌器的基础上研制开发出来的，主要是将通气腔中原笼式搅拌器中的单层丝网改为双层丝网，以增大丝网面积，使流入通气腔的培养液更多，提高气液交换量，可以克服笼式搅拌器氧传递系数低的缺点。桨式搅拌器结构与水平面成45°，这种设计可以在低搅拌转速下也能达到均匀混合的目的，因此非常适合低剪切力场合。海船式搅拌器的3个叶片与水平面成30°，专为对剪切力非常敏感的细胞，尤其是微载体培养系统而设计的。培养液数天更换一次，以确保营养物质的浓度和排除代谢产物。搅拌罐生物反应器的优点是简单实用、费用较低、但在以细胞培养为目的时机械搅拌产生的剪切力可能对细胞产生不利影响。

（二）微载体反应器

见本章第二节“微载体培养技术”。

（三）灌注培养反应器

尽管上述反应器在实际应用中取得了一些效果，但机械混合会在反应容器中产生剪切应力梯度，这在某些场合是有害的。为消除这种剪切力，可以用空气鼓泡或使微载体流态化来替代桨叶的机械搅拌。另一个消除剪切力的方法是采用灌注反应器。该反应器在原理与操作上与一般化工生产中的连续釜式反应器类似，将种植了细胞的支架悬吊于灌注系统中，培养液以恒定流量被连续地泵送到反应器中，再连续地收集到废液瓶中。所以，灌注反应器克服了机械混合产生的剪切力，可以方便精确地控制细胞的周围环境，包括pH、温度、培养液的营养成分、代谢产物等，因而培养细胞的密度及质量可以得到很大提高。以软骨细胞为对象，在灌注反应器中培养9d以后，细胞数目较静态培养显著增多。目前，该反应器一般只用于三维支撑骨架培养体系。一些新的灌注反应系统正在逐步趋于成熟。如用于培养肝细胞的动态种植培养系统。在该反应器中培养的肝细胞组织形态保持正常，表现出较高的代谢活性和白蛋白分泌能力。目前，组织工程皮肤的生产多采用本类反应器，如用于角质形成细胞规模扩增的Kerator反应器和生产Dermagraft的EVA生物反应器。

（四）旋转壁反应器

旋转壁反应器是一种水平旋转的、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统。其原型来自NASA评估微重力影响的装置，一般由水平放置的内、外2个同心圆柱组成。静态的内柱由半透膜构成，使得气体可以通过该膜进行交换。旋转的外柱由非通透性的材料制成。内外柱间充以连续灌注的培养介质及预先种植了细胞的微载体或三维支架在旋转的外柱及培养液的作用下自由下落。调节外柱的转速，使旋转产生的离心力刚好与重力平衡。在一些以三维支架作为细胞贴壁材料的实验中，该反应器在促进细胞外基质合成，保持细胞表型等方面也同样显示出一定的优越性，如种植在三维材料上成骨细胞在旋转壁反应器中可以合成更多的糖胺聚糖，同时由于细胞表型得以保持，使得其机械应力性能较静态培养和搅拌瓶培养都有了较大改善。用微载体作为细胞贴壁材料时，该反应器可以使细胞更好地聚集，从而促进大块组织形成，使得在回植体内时，甚至可以不用可植入基质材料，而且由于细胞处在微重力环境中，使得三维组织的形成更容易，其应用价值是明显的。

（五）其他新型生物反应器

人体细胞、组织的生存环境是多种多样的，有的处于应力环境中，如关节软骨需要负重，有的处于不间断的周期性的应力环境中，如心脏瓣膜。适应这些组织的培养要求，新的生物反应器不断出现。Voerstrup等报道了用于培养心脏瓣膜的脉动反应器，对组织采用物理施压和流动营养介质输入的培养方法，克服了传统反应器中培养的心脏瓣膜机械强度不高的缺点，为肌腱组织设计提供张力条件的反应器等，反应器个性化是生物反应器未来发展的方向。

三、生物反应器与组织工程

组织工程的基本策略是从人体取出一定量的细胞，经体外培植和与支架材料组合，回植体内患处，以达到组织重建或功能恢复的目的。细胞培养是组织工程的出发点，在保持细胞正常生理功能的前提下，经济、稳定、高密度地获得大量细胞，将成为组织工程研究的重点之一，而实现这一目标的最有效的方法就是应用细胞培养的生物反应器。

（一）组织工程对生物反应器的一般要求

不论以何种方式培养细胞，如果不是以人工诱变为目的，则其最根本的要求就是尽量在体外模拟该细胞在生物体体内的生长环境。而生长环境的某些偏差，会由于生长信号、化学信号、应力信号的阻断，要么导致细胞凋亡，要么导致细胞正常形态或生理功能的丧失。因此，生物反应器在组织工程中显示出其重要性，除在种子细胞增殖、组织块建构培养扮演重要角色外，生物反应器尚能控制pH、溶氧、机械应力、营养供给及代谢物移除等条件，为细胞的生长、分化和发育分化提供最适宜的环境。一般而言，应用于组织工程的生物反应器应满足以下一些基本要求：①安全，防污染，方便操作，有很好的生物相容性，能很好地模拟细胞在体内的生长环节；②生物反应器的形式和结构应便于培养介质的均匀混合，提供精确的传质控制，使营养组分的浓度及介质的pH能在时间和空间上尽量维持恒定，并使其梯度尽量减小；③能方便而精确地控制恒温，以利细胞生长；④培养介质的混合方式应使剪切力对细胞造成的损伤降到最低；⑤对于某些种类的细胞而言，还要求反应器能提供一定的机械应力刺激；⑥应能与细胞及组织培养所用的人工基质完美地整合；⑦不同于植物细胞和微生物细胞，动物细胞必须贴壁培养，所以应用于组织工程的生物反应器必须具有适宜的形式，为动物细胞提供贴壁环境。

（二）生物反应器在组织工程中的应用

1．种子细胞的培养 种子细胞是构建工程化组织的基本元素。其获取和扩增是组织工程要解决的首要问题。目前，许多实验室是利用培养瓶进行种子细胞的扩增培养，设备要求低，易于操作。但存在许多缺陷，如果组织缺损体积较大，平面单层培养在短时间内很难满足组织构建所需种子细胞数量；且培养过程需多次消化细胞，既损伤细胞，又容易造成污染，操作繁杂。频繁换液增加了污染概率、浪费人力；细胞在培养瓶中是二维生长方式，与体内所处的三维方式迥然不同，长期培养将导致细胞表型改变，如软骨细胞在二维培养状态时，扩增3～5代后，Ⅱ型胶原表达将丧失。构建工程化组织往往需要大量的种子细胞，联合应用微载体和生物反应器可以在较短时间大量扩增种子细胞，满足构建组织的需要。

微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术，现已广泛应用于生物工程领域。由于微载体有较大的比表面积，置入生物反应器中培养细胞，从理论上讲，相同容积的生物反应器和普通培养瓶相比，前者可比后者多培养数十倍甚至上百倍的细胞，可以满足较大体积组织构建对种子细胞数量的需求。不仅如此，微载体培养细胞可避免或减少了普通培养方法普遍存在的细胞去分化现象，有利于细胞表型的维持，提高细胞的质量。谭文松等利用微载体生物反应器成功进行了人皮肤Fb的培养，除了能提供足够的细胞贴壁面积之外，还能有效控制O2和pH，使细胞培养环境能维持均一和稳定，间歇换液也能消除副产物的毒性反应。利用1．5L反应器可培养皮肤Fb 2．5×109个，可满足构建2 500cm×2 500cm组织工程皮肤的需要。微载体和生物反应器为解决构建大面积皮肤组织所需的细胞提供了富集途径。

2．体外构建工程化组织 体外组织构建是指组织细胞经体外扩增至一定数量后，将种子细胞种植在支架材料上，形成细胞－支架复合体，进行共培养形成组织工程器官或组织的过程。细胞和支架材料的共培养分为静态和动态两种。静态细胞培养是目前常用的技术，单层细胞培养即为静态培养，一般并不受营养限制，这是因为营养的被动扩散足以通过单层细胞10μm左右的厚度，但是当组织的厚度超过100～200μm时，氧气和营养的扩散就会受到明显限制。实际上患者组织或器官缺损的体积往往远超过这一临界值。显然，在静态培养条件下，为较大体积支架上的种子细胞提供足够的氧和营养物质并排出代谢产物是很困难的，生物反应器提供的动态培养可使这一状况得到明显改善，生物反应器内液体的流动使支架内的氧及营养传质更充分，代谢产物更容易排出，细胞基质分泌更多，细胞分布更均匀合理，细胞表型得以更充分的表达，种子细胞可达到远超过被动扩散的深度。更为重要的是，生物反应器能提供很多培养组织所需的物理信号。适宜的物理信号可使组织构建过程更接近自然生长发育过程，使其生物构造及生物性能更接近正常组织，如肌腱、骨、软骨、皮肤等组织在正常发育时需要一定形式的机械应力，生物反应器提供的机械刺激使组织构建更接近体内正常环境，使组织工程器官更接近正常。Wendt等经过比较发现，使细胞悬液直接缓慢通过支架材料的动态种植方法优于静态接种和转瓶种植。大部分的支架材料均可以利用自动化的可控技术进行高效的种植，这类生物反应器既可以用于动态种植细胞，也可用于细胞－材料复合体的灌流培养，避免了组织块更换不同反应器所增加的不利因素，现已成功用于组织工程软骨、血管、心肌、皮肤等的制备及移植研究。

3．组织工程皮肤和生物反应器 组织工程皮肤的进一步发展还有很多问题有待解决，利用生物反应器构建组织工程皮肤是其中一个研究方向。其设计步骤Fb接种于真皮基质中塑形，再在其表面接种KC，真表皮复合物可在生物反应器中置于气液界面培养，最终形成成熟的组织工程皮肤产品。为了满足不同的组织工程皮肤产品的要求，皮肤生物反应器的设计第一原则是通用性要好。另外，力学刺激是体内细胞生长所必需的，因此能够在皮肤构建过程中提供力学刺激是第二原则。第三原则是气液界面培养是组织工程皮肤良好生长所必需的，所以皮肤生物反应器最好能提供气液界面培养条件。生物反应器能够最大限度地模拟体内环境，促进组织工程化产品的熟化。被美国FDA批准用于临床治疗的组织工程皮肤Dermagraft就是ATS公司利用生物反应器来大量制备的，并实现了培养过程的部分自动化，产品比细胞简单复合于材料中的移植物具有更优的性能，在临床应用中取得较好的疗效。谭文松等发明了采用生物反应器制备双层活性皮肤的方法，包括以下步骤：以复合胶原海绵为支架材料，置于灌注式生物反应器的多孔支架上，将Fb悬液加入反应器中，灌注接种及培养，完成真皮构建后，接种KC，灌注培养，完成表皮构建。这样制备的双层组织工程皮肤具有一定机械强度、延缓降解速度、细胞和胞外基质在材料中分布均匀，批次之间差别小，构建的组织在解剖学结构上更接近天然组织。曹谊林等也发明了一种组织工程皮肤体外构建的新型生物反应器，也是采用灌流式培养，可以为皮肤的生长提供气液界面培养条件，为皮肤构建提供了相对封闭、无毒、无菌、充足氧供，并能模拟人体的生长环境。Prenosil利用KERATOR（一种自动膜生物反应器）制备了高活力、未分化的表皮细胞膜片，作为自体创面敷料，并带有显微视屏系统和图像分析系统，可监测细胞生长状态和调整培养基。

四、展 望

采用生物反应器进行细胞培养是获得大量哺乳动物细胞最经济、最有效的途径。但是由于动物细胞、组织种类的多样性，使得细胞培养材料、培养环境千差万别，在模型化的基础上，科学地设计、放大生物反应器，并根据细胞种类的不同对生物反应器的操作参数进行优化，使之适应各类细胞的培养要求，是生物工程、化学工程工作者的工作重点之一。