疫苗发展史

钩端螺旋体病（leptospirosis）是由一类致病性钩端螺旋体引起的自然疫源性急性传染病。其主要症状为黄疸、出血、眼结膜充血及肾衰竭等。作为一种独立的疾病系，1886年由weil首次报道，1917年Noguchi对各国分离的病原体做了系统研究，根据本病原体的形态称为钩端螺旋体（leptospira）。而后，世界各地纷纷发现各种钩端螺旋体病。除病人外，还在多种动物体内分离发现多种致病性钩端螺旋体。目前，几乎世界各国均有钩端螺旋体病例报道，至少已有77个国家已分离发现有致病性钩端螺旋体。

在我国，钩端螺旋体病存在已久、南方民间称为“打谷黄”、“稻热病”。中医将其列入瘟病范畴。但在近代医学文献中有科学证据者首推1934年汤泽光在广州监狱对3例weil病例的观察，并用其中1例病人的血液注射入豚鼠后，在被注射动物的肝脏切片中发现了钩端螺旋体。1939年钟惠澜等在北京发现2例无黄疸出血而有脑膜炎症状的典型钩端螺旋体病例。

1949年后，我国钩端螺旋体病的防治研究得到了发展。逐步掌握了我国钩端螺旋体病的流行特点、带菌宿主、疫源地特征及分布；早期临床诊断、肺大出血临床抢救和发病机制的探讨均取得了进展；建立了我国的钩端螺旋体菌种参考标准，对分离的地方菌株进行了血清学分类鉴定，从而摸清了我国主要流行菌型及其地理分布，为我国钩端螺旋体疫苗的生产和合理使用提供了科学依据；胎盘培养基和综合培养基先后研制成功并用于疫苗生产及大罐培育生产疫苗新工艺的创建，开创了我国独特的疫苗生产方式，为钩端螺旋体疫苗的发展作出了贡献。从1975年至今，在全国各省、市、自治区中从病人与67种宿主动物体内分离获得致病性钩端螺旋体；提出了脑动脉炎与钩端螺旋体的关系；开展了钩端螺旋体各群型间的抗原因子分析；综合培养基的改进取得了突破性进展，从而大幅度提高了钩端螺旋体疫苗的浓度，增强了疫苗的预防效果；新钩端螺旋体疫苗的研究诸如外膜疫苗、活菌疫苗、核酸疫苗及重组基因工程疫苗等研究获得了较大进展；细胞免疫和脂多糖的研究得到了发展；单克隆及各种新方法得到了应用，并对我国的主要流行菌型赖型钩端螺旋体菌种进行了DNA序列分析；由于采用了综合性的防治措施，降低了许多重点疫区的发病率，使我国钩端螺旋体病的疫情得到基本控制。

钩端螺旋体病在《中华人民共和国传染病防治法》中列为乙类传染病进行管理。

【病原学】

1．形态 钩端螺旋体是一类形体细长、柔软、弯曲、螺旋盘绕细致、规则而紧密的单细胞微生物；其直径约0.1µm，长度为6～20µm。苯胺染色不明显。在普通显微镜下不能看见，但在暗视野或相差显微镜下能观察到。钩端螺旋体一端或两端弯曲成钩状，常使其形体呈C状或S状。钩端螺旋体运动活泼，在液体环境下，其特征运动表现为沿着长轴旋转、两端柔软，呈扭动运动；钩端螺旋体为需氧菌，在1%琼脂培养基表面下形成松散的菌落，在2%琼脂培养基表面形成混浊清亮的菌落。最适培养温度为28～30℃。钩端螺旋体以横分裂繁殖，每6～18h分裂1次。

2．结构 在电子显微镜下，钩端螺旋体的基木结构由外膜、鞭毛（轴丝）及柱型原生体（原生质柱）所组成。

（1）外膜：外膜位于柱形原生质体与鞭毛外层，相当于细菌的荚膜。外膜组成中多糖为17%～18%，脂类为13%～18%，蛋白质为4%。罗海波等曾用黄疸出血群赖型钩端螺旋体外膜置100℃加热1h，并用1mol/L盐酸及1mol/L氢氧化钠分别处理，使酸碱度调至pH 2.0及pH 10.0，作用1h，结果凝集原略有下降，免疫力也减低。说明过酸过碱或过热均可使外膜失去部分活性。

外膜具有良好的抗原性与免疫源性、外膜位于钩端螺旋体的最外层，当感染时，宿主免疫系统首先受到外膜的刺激，产生外膜抗体。在机体内，抗外膜抗体在补体的参与下破坏外膜，从而杀死钩端螺旋体。自20世纪70年代以来，国内外学者对此进行了研究。1972年和1974年Auran等以外膜免疫金地鼠，用同型活菌攻击后，可100%免于实验动物死亡，且能防止肾脏带菌或排菌。张锦麟等对外膜疫苗进行了较深入的研究，经国家新生物制品审评通过，进行了近10万人群的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床接种反应和流行病学效果观察、疫苗接种反应轻微，黄疸出血群的保护效果达96%，证明外膜疫苗是安全有效的。

（2）鞭毛：钩端螺旋体有2根鞭毛，它们位于外膜与柱形原生质体之间。鞭毛附着在柱形原生质体近末端处，其游离端伸向细胞中段，互不重叠，可用理化方法提取。将提纯的鞭毛做化学测定，证实其中仅含有蛋白质。根据PAGE分析，纯化的钩端螺旋体鞭毛中含有6种不同的蛋白质，对其60℃加热60min仅部分被破坏。纯化的钩端螺旋体鞭毛总氨基酸约含2.7%，有16种氨基酸，其中以谷氨酸、精氨酸及亮氨酸为主。Nauman观察结果证明，各种酶类作用于鞭毛1h无作用，而过酸（pH 2.4）、过减（pH 12）、加热（60℃ 30min）及各种化学药品（50%乙醇、尿素等）均能使鞭毛部分或全部裂解。

1974年张师鲁等以15个血清群的36株的钩端螺旋体的鞭毛抗原与鞭毛免疫血清做琼脂扩散试验，可将钩端螺旋体分为8个血清群，这种分群与通常的凝集试验分类法无关；近年，Keslon等以凝胶电泳和免疫印迹技术证实，不论是致病性还是腐生性钩端螺旋体，鞭毛抗原均具有抗原性和免疫源性，可产生鞭毛抗体。该抗体在钩端螺旋体病中的免疫作用尚有待进一次探讨。

钩端螺旋体鞭毛为运动器官，其运动“能”来自插盘及终结的冲动，沿着鞭毛传递窦状波。由于窦状波的冲动，将“能”传送至螺旋状盘绕纤维（coiled fiber），因而产生旋转运动。刺激可来自两端，故钩端螺旋体可向两个方向运动。此外，鞭毛还有骨架作用。

（3）柱形原生质体：柱形原生质体为螺旋状圆柱形结构，与鞭毛互相缠绕，常使菌体受压部分形成凹陷。钩端螺旋体进行横分裂时，在菌体中部可见到中隔板（septa cell）。柱形原生质体由膜系统与鞭毛终端器官相连接。细胞壁主要组分是多糖和肽聚糖。此外，尚有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖与葡萄糖，以及丙氨酸、谷氨酸与氨基葡糖。胞壁复合物外层含有肽聚糖。

3．抵抗力 钩端螺旋体较为脆弱，不耐干燥，也不耐热。经加温50℃ 10min或60℃ 10s即死。动物体内排出的钩端螺旋体在自然条件下因pH不同，其生存的时间长短不一。在潮湿的土壤中生存6h～15d，也有人证实生存43d～6个月。钩端螺旋体在水中的生存期限，取决于水温、酸碱度、化学成分及其中的微生物与植物生长情况，一般可活存18h至8个月。

钩端螺旋体感染的血液，置37℃经8d存放仍能使豚鼠于18d后发病。感染的肝脏，在-20℃中可保存75～100d，在4℃保存20d。在感染的尿液中生存28～50h，如尿中污染杂菌，则被杂菌迅猛的繁殖所抑制。

钩端螺旋体对多种化学物质均无抵抗力，0.1%的盐酸、硫酸、甲酸或醋酸作用10～15min即死；0.05%苯酚迅速将其杀死；1%苯酚中30min死亡；水中含氯量超过0.3～0.5 µg/ml，1～3min死亡。

钩端螺旋体对抗生素的抵抗力因所用浓度而异。在低浓度时对钩端螺旋体有抑菌作用，在高浓度时能使钩端螺旋体运动丧失，形态变长，感染力消失，最终死亡。其中以青霉素与金霉素的杀菌作用最强。

4．致病作用与致病机制 各型致病性钩端螺旋体对人类的致病作用是不同的。有的可引起严重感染，出现黄疸、出血，甚至死亡；而有的则仅有轻微的临床症状或毫无症状。即使属于同一血清型的菌株，在不同地区也有差别。如流感伤寒型钩端螺旋体在欧洲致病力很低、临床症状也轻，而在中非和以色列则可引起严重症状，甚至导致死亡。对于实验动物的致病力也是如此。一般来说，多数致病性钩端螺旋体菌株对幼年豚鼠或地鼠有致病力，但致病力的强弱各菌株之间也并不在一个水平上。事实上也没有一种实验动物对所有的致病性钩端螺旋体菌株是敏感的。致病性钩端螺旋体经长期人工培养可丧失部分毒力，但若再经过豚鼠或地鼠反复传代，其毒力可望获得恢复。因此，为保持钩端螺旋体菌株的毒力，应定期通过动物传代。

（1）致病作用：致病性钩端螺旋体经水通过正常或损伤的皮肤、鼻腔、口腔、胃肠黏膜而进入机体，迅速地从体液和淋巴系统散布到全身，产生钩端螺旋体血症。钩端螺旋体首先在血液中大量繁殖，并进入身体各组织器官，使机体所有组织和器官不同程度地受到侵害。钩端螺旋体血症持续1周左右出现毒血症，造成全身细血管、肺、肝、肾、心脏和中枢神经系统器官的损害。钩端螺旋体也侵入细胞，引起细胞超微结构变化，出现败血症状。因此，钩端螺旋体病是一种全身性的中毒败血症。钩端螺旋体侵入机体后，首先出现一系列非特异性免疫反应，末梢血管多核型白细胞增加，白细胞不同程度吞噬钩端螺旋体，出现轻度炎症反应，但从不化脓。机体单核细胞增殖，肝、脾等单核细胞吞噬钩端螺旋体能力明显增强。随之淋巴细胞、浆细胞增殖，出观特异性抗体。

钩端螺旋体在组织器官内生长、繁殖和机体出现特异性免疫反应。从而引起发热、眼后发症或神经系统后发症的出现。这是机体在排除钩端螺旋体过程中发生的一系列损伤反应。

①感染毒血症期（发病3d内）。钩端螺旋体在血液中生长、繁殖和不断裂解死亡，造成钩端螺旋体血症和毒血症，病人出现典型的全身感染中毒症状和一些局部典型病变。在此期间，无明显肝、肾、心、肺和脑等损伤性病变。

②器官损伤期（发病4～14d）。在钩端螺旋体血症和毒血症的同时出现肝、肾、心脏、肺和脑等组织有明显损伤。临床上显示肺出血型、肺弥漫出血型、休克型、黄疸出血型、肾衰竭型或脑膜脑炎型。

③恢复期或后发症期（发病7d或14d以后）。经过败血症期后，多数恢复健康，不留后遗症，称为恢复期。少数可出现严重的眼或神经系统后发症，故称后发症期。

（2）致病机制：钩端螺旋体病临床表现复杂多样，但其病变相同。

①黄疸。黄疸是钩端螺旋体病的重要症状与体征，系钩端螺旋体及其毒素引起胆红素代谢障碍所致。主要表现为血中胆红素含量增高，使巩膜、黏膜和皮肤等组织黄染。其机制与下列因素有关：肝细胞损伤，使肝细胞对游离胆红素的摄取、结合、形成和胆汁分泌发生一系列障碍从而引起黄疸；有些型别的钩端螺旋体能产生溶血毒素，如果红细胞破坏过多，游离胆红素在数量上超过肝脏代偿能力所能处理的范围，使血内胆红素发生滞留；胆管阻塞及肾功能不全均可促进黄疸加剧。

②出血。出血是钩端螺旋体病的常见病变，发生在皮肤、黏膜、浆膜和脏器等处。肺出血是钩端螺旋体病人早期死亡的主要原因，其机制各家说法不一，多数学者认为与毛细血管损伤有关。大量的钩端螺旋体毒性物质作用于血管壁使之损伤，以致毛细血管通透性增强，导致全身器官点状出血或瘀斑，严重者引起便血及肺弥漫性出血，临终时表现为口鼻涌血。

（3）后发症

①眼后发症。钩端螺旋体葡萄膜炎是钩端螺旋体病最为常见的后发症，主要发生在钩端螺旋体病晚期。大多侵犯双眼，影响视力，危害较大。发病机制可能与钩端螺旋体或其L型进入眼内或因钩端螺旋体所致的自身免疫或变态反应有关。

②神经系统后发症。可有两种类型，一类是在急性钩端螺旋体病后恢复期出现的后发症；另一类是在钩端螺旋体隐性或轻型感染后出现的后发症。国内常见的临床类型有如后发脑膜炎、后发脊髓炎及脊髓蛛网膜炎、后发多发性神经炎及后发脑动脉炎等。其发病机制可能与钩端螺旋体或其L型直接损伤血管和Ⅲ型超敏反应有关。

5．遗传与变异 钩端螺旋体可受外环境的影响而发生遗传变异。实验研究已证明钩端螺旋体菌株可发生抗原变异。钩端螺旋体菌株的毒力的改变，可因在试管中长期多次传代后，使其毒力降低甚至消失。

1943年Bassemann等在培养基中加入同种或异中抗血清的特定条件下连续作用4代后可产生血清学上不同的菌株。此后Pike将流感伤寒型、犬型及波摩尔型钩端螺旋体长期培养于含有相同抗血清培养基中，可导致钩端螺旋体血清学特性的明显改变。

1978年Yanagawn将黄疸出血群哥本哈根型钩端螺旋体无毒菌株接种于小鼠体内，感染后7～13d将小鼠处死，取其肾脏培养于含有相同抗血清的液体中或固体培养基上。结果在15只接种钩端螺旋体的小鼠中有11只肾脏培养分离出变种，其中M15和M131变种与亲代株作交叉凝集素吸收试验比较，发现这2株变种在抗原上不尽相同，且与亲代株也不一致，为新的血清型。为观察变种的抗原稳定性，于10～14个月将变种通过液体培养基培养5～7代，其抗原性与原始株并无不同。进一步做豚鼠保护力试验，即将亲代菌株死疫苗接种豚鼠体内，然后用亲代株活菌攻击，可保护豚鼠免于发病或死亡，也可保护豚鼠免受M131株的攻击。以变种M15、M124免疫豚鼠，不能保护亲代株及M131株的攻击。上述动物实验表明，在动物体内可能出现已知血清型的抗原变种。该变种自动物尿中排出，然后侵犯其他动物，可以视为新的血清型感染。因此，在自然环境中钩端螺旋体抗原性的变异也应肯定。目前已知的众多血清型或基因型及其新型的不断发现，也说明钩端螺旋体变异的存在。

关于钩端螺旋体产生抗原变异的原因，可能是钩端螺旋体在生长发育的过程中存在着突变的潜能。此种抗原变异应从遗传的、有条件的变异来理解。

据观察，钩端螺旋体抗原遗传的稳定性是主要的，也存在着变异问题，即具有相对的稳定性。就在血清群的范围内，钩端螺旋体仅有微小改变，超过血清群范围的改变极为少见。钩端螺旋体抗原的稳定性对流行病学工作十分重要，否则很难进行流行病学调查、疫苗制造及预防。

【流行病学】

1．流行概述 根据临床和血清学诊断，几乎世界每个国家都有钩端螺旋体病存在或流行。经病原分离证明有钩端螺旋体病存在的国家至少已有77个。每年发病人数有数十万，还不包括洪水引起的流行在内。据统计全世界有200多种动物携带钩端螺旋体，在170多种动物中分离出钩端螺旋体。家畜的感染相当严重和普遍，可给畜牧业带来巨大的经济损失，成为一种重要的人畜共患疾病。

钩端螺旋体病疫源地可分为两类，一类以啮齿类动物为主要储存宿主的自然疫源地，不论平原、山地、森林、沼泽地、盐碱地、沙漠绿洲等地区均有存在；另一类以猪、牛、羊等家畜动物为主要储存宿主的经济疫源地，在已开垦的农业和畜牧区普遍存在。在长江流域及其以南地区自然疫源地和经济疫源地同时存在，又称混合疫源地。

2．传播方式 传播钩端螺旋体的方式有多种，主要是通过宿主动物含菌的尿液污染水源和土壤，人接触后由皮肤或黏膜、特别是破损的皮肤或黏膜侵入机体。

（1）接触疫水传播：接触疫水感染是该病的主要感染方式，约占病人总数的90%。稻田、池塘、沼泽、水沟及小河附近，是鼠类及蛙类栖息场所，又是家畜猪、牛等吃草、饮水之处，常被带菌宿主动物尿液所污染。当人们从事种植、收割稻谷、洗菜、游泳、捉鱼、防洪排涝等活动时即可接触疫水而感染发病。

（2）直接接触感染：直接接触感染指接触鼠及家畜尿液或其污染物引起发病，多见于饲养员、屠宰工人、兽医等职业。

（3）其他途径感染：钩端螺旋体可通过胎盘感染胎儿，引起流产或早产；昆虫诸如蜱、螨、蚊、蝇、蚤等可通过机械携带传播；蜱、螨等还可自然感染体内繁殖，经吸血而传播。

3．流行特点

（1）地区分布：我国除香港与澳门未见报道外，各省、市、自治区（包括台湾省）均已发现有钩端螺旋体病人或带菌宿主动物。在全国有60%以上的县有该病的散发或流行，在长江流域及其以南地区流行最为严重。尤其是四川、湖南、湖北、江西、云南、广东、广西等省区。

（2）季节分布：一年四季均可有病例发生，7～10月份的病例数占总病例数的93.19%，尤以8～9月病例最多，约占64.91%，具有明显的季节性。稻田型钩端螺旋体病的流行高峰在8～9月，故此病被群众俗称为“打谷黄”。洪水型或雨水型的流行高峰与洪水泛滥及内涝时间相关。

（3）人群分布：各年龄组均有，但以15～34岁的青壮年发病最多，占总病例数的71.17%。稻田型钩端螺旋体发病年龄偏高，洪水型和雨水型年龄偏低。年龄分布还有一定的地域差异，北方10～14岁、南方15～19岁的病例最多；男性病例显著多于女性，黄河流域男性病例占76%，长江流域男性病例占67%，显然与田间劳动和接触疫水有关；钩端螺旋体病病人以农民为主，占总病例数的79.87%，学生次之，占12.64%，职工和学龄前儿童所占比例甚小。

4．流行形式

（1）稻田型：参加稻田劳动、开垦荒塘荒田和沼泽地、积肥及从事其他农田劳动，受到钩端螺旋体感染发病者均属稻田型。我国长江流域及南方水稻区以此型为主要流行形式，在收获季节发病人群较集中为本型的特点。主要传染源为黑线姬鼠，黄疸出血群钩体为主要菌群。近年来河南、安徽和吉林也报道有稻田型。

（2）洪水型：夏秋季洪水泛滥平原地区，畜舍、厕所等被冲溢，带菌动物的排泄物污染环境，广大群众与洪水接触所发生的流行。我国黄河流域及其以北地区以洪水型流行为主。本型发病人数多呈暴发流行，常于洪水后3～4d开始发病，9～14d达高峰，一般1个月内流行终止。以猪为主要传染源，波摩那型为主要流行菌型。近年来，山区由于山洪暴发也有洪水型流行，鼠类为传染源，流行菌型较为复杂，可有赖型、临海型或巴叶赞型等。

（3）雨水型：本型主要发生在平原低洼地区，大雨后地面积水增加，一时难以排泄，滞留时间较长，村屯内外沟渠、厕所、家畜饲养场所都为雨水冲洗，低洼地和河沟水满为患，增加人群接触疫水的机会，造成雨后构端螺旋体病的流行。我国绝大部分省区均发生过雨水型流行。本型流行持续时间较长，也以猪为主要传染源，其他家畜也有一定传染源作用。

（4）其他形式：可在江河、水库、水溪、池塘等处游泳而引起流行，在我国已有多次报道。因猪感染率高，尿中排菌量大，猪圈内潮湿、积水或泥泞，钩端螺旋体污染严重，饲养员进入猪圈内而被感染，在上海与福建等地有过记载。

5．动物宿主 目前已从37种哺乳动物（包括啮齿目、食虫目、食肉目、兔形目、偶蹄目、灵长目）、8种蛙类（沼蛙、泽蛙、黑斑蛙、棘胸蛙、虎纹蛙、滇蛙、日本林蛙、台北蛙、蟾蜍）、6种家养动物（牛、羊、犬、骡、马、猫）、3种实验动物（小白鼠、家兔、鼠）、2种鸟类、2种爬形动物（马鬃蜥、泥蛇）、1种鱼（黄鳝）和1种节肢动物（毒棘厉螨）中分离出钩端螺旋体，同时证明体内带菌，除鸟类、鱼类和节肢动物目前还没有证实外，其他均能向体外排菌。由此可证明绝大多数均可成为传染源。

钩体的带菌动物很多，鼠类是许多菌型的主要储存宿主。鼠（黑线姬鼠、黄毛鼠、黄胸鼠和褐家鼠）是我国长江流域及其南方省、区稻田型钩体病的主要传染源。猪（犬）等家畜是我国北方和南方洪水型、雨水型钩体病流行或暴发的主要传染源。近年研究表明牛尤其是耕牛是七日群钩体病的重要传染源。钩体在动物的肾脏生长，菌随尿排出，污染水及土壤。由于猪和牛尿量大排菌量多又与人接触频繁，因此对人威胁很大。带菌期猪排菌可达1年，鼠、犬排菌可长达数月至数年。

6．流行菌群与菌型 我国的主要流行菌群菌型是黄疸出血群的赖型，波摩那群的波摩那型，犬群的犬型，秋季群的秋季型，澳洲群的澳洲型，流感伤寒群的临海型，七日热群的七日热型，巴达继亚群的巴叶赞型和爪哇群的爪哇型。但各地区主要流行菌群菌型的分布有所不同。从全国角度看，最主要的是黄疸出血群的赖型，波摩那群的波摩那型。它们的流行面积广，危害严重，分别为我国稻田型与洪水型、雨水型的钩端螺旋体病的主要病原体，分别占我国分离鉴定菌株总数的39.97%与20.91%。流行群型除在不同地区有差别外，在同一地区因不同年代可发生主要流行群型的更迭。

7．防治措施 钩端螺旋体的防治工应贯彻预防为主的方针，才能有效地控制该病的流行。对流行严重的地区进行流行病学监测，根据实际情况采取相应措施，降低发病率，同时贯彻“三早一就”的原则，及时诊治，降低病死率，保护劳动者，保证农业生产的发展和人民的健康。

（1）管理传染源

①灭鼠。鼠类可作为多种疾病的传染源，为钩体病的主要传染源，对人类危害极大。可因地制宜，在每年2～3月及9～10月鼠类繁殖高峰时采用多种有效方法灭鼠。尤其是田间鼠应首先灭杀。

②管理好牲畜。结合两管（管水、管粪），五改（改良水井、厕所、畜圈、炉灶、环境）开展圈猪积肥。猪是我国南北方洪水型及雨水型钩体病流行的主要传染源，为此要开展圈猪积肥，注意家畜粪尿无害化处理，不让粪尿污染阴沟，池塘、稻田、河流、水井等水源，防止雨水冲刷猪圈。在流行区加强病畜检查和治疗，可给猪注射兽用钩体菌苗，一旦发现带菌猪，应及时用链霉素治疗。此外对犬的管理十分必要，因犬的带菌率很高。

③病人。及时隔离治疗，并对其血、尿、痰严格消毒管理。

（2）切断传播途径：结合农田基本建设，改造各种类型的波源地，如山垄地田和荒塘等。主要是开沟排水，减少积水，建立合理的排灌系统地和掩蔽场所，改死水为活水，治理烂泥田、疏浚水沟低洼，防止雨后积水。收割水稻前可放干田中积水，也可对污染的水源、积水用漂白粉及其他有效药物进行喷洒消毒。减少不必要的疫水接触，流行季节避免在河塘游泳或涉水。管理好饮食，防止鼠类排泄物污染。

（3）保护易感人群

①加强宣传教育。使疫区群众掌握钩端螺旋体的防病知识，增强自我防病意识。流行区、流行季节、必须与疫水接触者尽可能穿长筒靴、戴胶皮手套，防止皮肤破损，减少接触机会。并培训专业队伍，不断提高医务人员的防治理论和诊疗水平，贯彻“三早一就”的原则，对病人做到早发现、早诊断、早治疗和就地治疗，降低病死率。

②菌苗接种。积极组织钩端螺旋体疫苗的预防接种，增强人群的免疫力。根据当地流行菌型组织供应对型疫苗，才能发挥疫苗的应有的预防效果。对发病较高的重点流行区应进行疫苗普种；对历年发病较低的地区，根据钩端螺旋体病流行病学监测结果指导疫苗的预防接种，保护外来人员和易感人群。

【临床表现与相关疾病鉴别】

1．诊断方法 单凭临床表现确诊钩端螺旋体病比较困难，应结合流行病学资料和实验室诊断才能获得正确可靠的结论。

（1）流行病学史：流行病学的资料分析是诊断钩端螺旋体病的重要依据。即使是轻型非典型性病例，根据流行病学资料、诊断也易于确立，减少误诊。在钩端螺旋体病流行区，流行季节，在发病前l～2周曾参加过稻田劳作、游泳、接触过疫水以及共同劳动者中曾有发病者，对钩端螺旋体病早期诊断，特别是非典型病例的诊断具有实际意义。

（2）临床表现：“三症三征”是钩端螺旋体病早期诊断的主要依据，但并不是每例病人都具有这“三症三征”。对其他症状与体征如发热伴有鼻出血、咽腭黏膜充血和小出血点、急性胃肠炎样症状应进行细致分析，结合流行病学资料，对早期临床诊断尤其是一些非典型病例的诊断很有帮助。

（3）血、尿化验检查：周围血中白胞计数轻度增高或正常、红细胞沉降率加快，尿液中出现蛋白质、红细胞管形，有利于支持该病的诊断。

（4）病原学和血清学诊断：对早期血液或脑脊液的钩端螺旋体病原菌株的分离培养，以及血清学抗体的检验，特别是双份血清的对比试验结果，对确诊该病十分重要。

2．临床表现 潜伏期2～26d，一般7～13d，平均10d，按其病情发展，临床上常分为3期。

（1）早期：又称钩体血症期，一般在起病3d内。此期钩体在血中大量繁殖，出现下列感染中毒综合征。

①发热。多数病人起病较急，短时期内体温可达39℃左右，伴有畏寒，少数有寒战。热型为稽留热，部分病人为弛张热。

②头痛、肌痛。全身肌肉酸痛显著，尤以腓肠肌以腰背肌痛更为突出。颈肌及胸腹部肌肉疼痛也较常见。

③全身乏力。下肢软弱，甚至无法站立和行动。有时其他症状虽不重，而腿软及全身乏力也可显著。

④眼结膜充血。可于起病第1天即可出现，并很快加剧。其特点一是无分泌物、眼不疼痛，不畏光感；二是充血持续较久，退热后数天仍可存在。

⑤腓肠肌压痛。多为双侧，少数病例仅为单侧疼痛及触痛。轻重程度不一，轻者仅有小腿胀感，轻度触痛；重者轻触即痛，拒压。有时肺大出血者反而此征不明显也有之。

⑥表浅淋巴肿大与压痛。发病后第2天就可出现，以腹股沟淋巴结肿大最为常见，一般为轻度肿大，少数可大如鸽蛋，质较软，局部无红肿，亦无化脓，可有痛感及压痛。也有无淋巴结肿大者。

除上述综合症状外，尚可有恶心、呕吐、腹泻等消化系统症状；咳嗽、咽痛等呼吸系统症状。部分可有肝脾大及出血倾向。

（2）中期：本病轻重差异很大，根据不同临床表现，可归纳为5型。

①感染中毒型。感染中毒型又称流感伤寒型。它是临床上最常见的一种类型，无明显的组织与器官损伤表现，主要特征是具有“三症和三征”，即“寒热、酸痛、周身乏；眼红、腿痛、淋巴结大”。一般而言，该型病情较轻，但也可演变为重症，如肺出血型、肺弥漫出血型等。部分病人退热后可出现“眼蒙”，视物模糊，其至失明。因此，当出现“三症三征”时，就应立即就诊，早期抗菌治疗，就可制止疾病的发展。

②肺出血与肺弥散出血型。该型是引起钩端螺旋体病死亡的主要类型，主要特征仍然是“三症三征”，并有肺出血的象征，即咳嗽，痰中带有鲜血；还可出现咯血、气喘、呼吸增加。该型中有些病人病情凶险，发展迅猛，口鼻涌血，不治身亡。由于他疾病很少引起口鼻涌血，因此，口鼻涌血是钩端螺旋体病的独特现象。

③黄疸出血型。该型是钩端螺旋体病中病程最长和病情最重的一型。它最先被Weil发现，故在以用的很长一段时间内被称为Weil病。该型病人全身皮肤、黏膜黄染，并伴有寒热、酸痛、周身乏力，眼红、腿痛和淋巴结肿大等症状和体征。

④脑膜脑炎型。该型的特点是除“三症三征”外，同时还具有脑膜炎或脑炎的症状，剧烈头痛、频繁呕吐、颈强直、怕光流泪等症状与体征。

⑤肾型。该型特点是除“三症三征”外，并伴有明显的蛋白尿、血尿、管形及不同程度的肾功能障碍和氮质血症等。

（3）恢复期或后发症期：少数病人热消退，恢复后可出现下列后发症

①后发热。经有效治疗或自愈后3～5d，再出现发热，体温在38℃左右，半数病人周围血中嗜酸性粒细胞增高，此时血中无钩体，不需抗生素治疗，发热在1～3d消退。极个别可出现第3次发热，3～5d自退。后发热与抗生素剂量、疗程无关，可出现在青霉素治疗过程中。

②眼的后发症。主要发生在波摩拿型钩体，我国北方多见。在钩体病退热后1周至1个月发生，以葡萄膜炎、虹膜睫状体炎、脉络膜炎主为，巩膜表层炎、球后视神经炎及玻璃体混浊等也可发生。

③反应性脑膜炎。少数病人在后发热同时或稍后出现脑膜炎症状与体征，但脑脊液无异常且钩体培养阴性，不治可自愈。预后良好。

④闭塞型脑动脉炎。多数隐性感染后发生此并发症，常见波摩拿型钩体病流行后2～5个月，最长在病后9个月才出现症状。15岁以下儿童发病较多，占本症发病率的90%。临床表现多为偏瘫、失语，可短暂的反复发作。脑脊液蛋白质可轻度增高，白细胞轻至中度增多，脑脊液做钩体补体结合试验与显微镜下凝集试验部分阳性。血清钩体补体结合试验与显凝试验阳性。脑血管造影证实颈内动脉窦上段和大脑前中动脉近端有狭窄，多数在基底节有一特异管网。预后较差。

3．与相关疾病鉴别 由于钩端螺旋体病临床表现复杂，而且非典型病例亦较多，特别是散发病例易于误诊，因此，在临床诊断中应与常见的急件传染病进行仔细鉴别。

（1）流感伤寒型：应与流感、上感、伤寒、流行性出血热（发热期）、败血症等进行鉴别，还应注意与不典型的疟疾、急性血吸虫病、恙虫病及肺炎等相区别。鉴别时，本病的临床特征、流行病学史及尿液检查的发现及氮质血症等可为鉴别诊断提供重要线索。病原学及血清学检查为诊断根据。

（2）黄疸出血型：应与急性黄疸型病毒型肝炎鉴别，后者主要症状为食欲明显减退，厌油，发热不高，中毒症状不重，无眼结膜充血及腓肠肌压痛，白细胞计数正常或减少，肝功能明显异常，肌酸磷酸激酶不增高，非重症肝炎出血倾向不明显，小便中无蛋白质及细胞、管形等异常发现。黄疸出血钩体还应与急性胆道感染、急性溶血性贫血等病相鉴别。

（3）肾衰竭型：应与流行性出血热、肾炎等相鉴别。

（4）肺出血型：应与大叶性肺炎、肺结核、支气管扩张、肺肿瘤进行鉴别。经X线肺部摄片或CT等检查可以区别。

（5）脑膜脑炎型：应与病毒性脑炎、结核性脑膜炎等鉴别。病毒性脑炎无疫水接触史、无腓肠肌压痛等。结核性脑膜炎起病多不急，无疫水接触史，脑脊液蛋白质增高较明显，糖与氯化物减少，与钩体区别。

【实验室诊断】

1．血常规检查 白细胞总数和中性粒细胞略高或正常，红细胞沉降率增高。

2．尿常规检查 大多数病人有轻度蛋白尿，镜检可见红细胞、白细胞和管型。

3．特异性检查

（1）钩端螺旋体直接镜检和分离

①血液的直接镜检。取早期病人血液1滴，加蒸馏水1滴，使血细胞溶解，在暗视野显微镜下检查有否活动的钩端螺旋体。取早期病人静脉血1～2ml于无菌试管中待凝固，离心沉淀，吸取血清与血细胞交界处略显白色的悬液，涂片后暗视野显微镜检查有否活动的钩端螺旋体。差速离心暗视野检查法，采集早期病人静脉血1ml，加于含2ml枸橼酸钠盐水管中，1 000r/min离心10min，吸上层血浆置另一清洁管中，3 000～3 500r/min离心30～60min，弃上清，取沉淀物1滴于玻片上，暗视野显微镜检查有否活动的钩端螺旋体。

②培养分离病原体。病人血液、尿液培养。采集早期病人血液，无菌操作接种于2或3管Korthof培养基中，每管接种1～3滴。血培养管置28℃培养。每隔5～7d取培养物暗视野显微镜下观察有无钩端螺旋体生长，若有生长，即为分离阳性。若未见生长，需继续培养60d，仍不见钩端螺旋体方作阴性处理。

接取病后2周以上的病人中段尿30～50ml于无菌离心管中3 500～4 000 r/min离心1h。取沉渣0.3～0.5ml接种于2－4管上述培养基中，28℃孵育。每隔5～7d取材镜检。为提高检出率和减少污染，可在采集尿标本的前一天晚上服碳酸氢钠（NaHCO3）2～4g，同时，在培养基中加入100～400 µg/ml氟尿嘧啶或1/2 000的磺胺嘧啶。

病人血液、尿液接种金黄地鼠或幼龄豚鼠（体重为120～140g））。

菌株分群，分型鉴定。应用分群血清与新分离的钩端螺旋体做凝集试验，确定菌群。应用交叉凝集素吸收试验或分型因子血清来确定菌型。

（2）钩端螺旋体核酸的检测：利用聚合酶链反应和分子杂交技术检测钩端螺旋体核酸。

（3）血清学诊断方法

①显微镜凝集试验（MAT）。

抗原的选择和制备。将我国15群15型钩端螺旋体代表株于Korthof或Tepck ии培养基中，28℃培养5～7d，暗视野显微镜检查，每400倍视野下不少于50条，运动活泼并无自凝者可作显凝抗原。

操作方法。病人血清56℃水浴灭活30min后，用生理盐水以1∶50（早期病人血清）或1∶100（恢复期）和1∶500做定性试验，两个稀释度血清以及作对照用的生理盐水各取50 µl，取15个代表株的培养液依次加入每列的3个孔中。摇匀后37℃孵育1.5～2h。用接种环挑取反应液及对照，放置载物玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况。若1∶100和1∶500稀释血清与某一群钩端螺旋体抗原发生凝集，需进一步稀释该血清与该群钩端螺旋体抗原凝集，以测定其凝集滴度。凝集滴度按原血清稀释倍数×2计算。

终点凝集滴度的判定。以出现（＋＋）凝集（即视野中50%钩体凝集）的血清最高稀释度作为终点凝集滴度。

②间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）。将超声波抗原包被于聚苯乙烯微量反应板。然后，依次结合待测抗体（第一抗体）和酶标抗体（第二抗体）。显色后，测读492nm处的吸光度值，待测标本吸光度值超过阴性标本2.1倍者可判为阳性。

③斑点酶联免疫吸附试验（Dot ELISA）。将超声波抗原包被于直径45µm的硝酸纤维膜，以下步骤与间接ELISA相同，过氧化氢－四氯-萘酚为底物有蓝色斑点者为阳性，无蓝色为阴性。以血清最高稀释度出现阳性者为滴度判定终点。病人血清滴度≥1∶20或双份血清滴度呈4倍增长者有诊断意义。

【疫苗的应用】

1．免疫学 自钩端螺旋体病的病原体被发现以后，就开始了对它的免疫学研究。研究资料证明，其免疫反应非常复杂。既有体液免疫、也有细胞免疫；既有特异性免疫，也有非特异性免疫；既可自动免疫，也可被动免疫。

（1）体液免疫

①抗原的种类。

全菌体及其成分。1982年Rey等用地鼠和犬对钩端螺旋体的外膜、原生质柱及全菌体制剂做了免疫源性的比较研究。以犬型、黄疸出血型、波摩那型和流感伤寒型钩端螺旋体制备3种制剂，以50%保护致死量和50%防止肾感染量为指标进行比较。结果3种免疫原的50%保护致死量相似。但外膜和全菌体制剂的50%防止肾感染量值为0.05～0.8µg（干重），而原生质柱制剂则为7.0～14.0µg。因此，全菌体和外膜就防止肾感染而言，其免疫源性较原生质柱为强。

脂多糖。钩端螺旋体脂多糖是—种保护性抗原。1974年Faine等从钩端螺旋体中分离出脂多糖，用小鼠做试验，每只动物免疫注射50mg（含有不完全福氏佐剂），可保护小鼠免于死亡，但不能防止肾感染。

红细胞致敏物质（Ess）。钩端螺旋体的Ess既具有抗原性，又具有免疫源性。以脂质体为载体，将钩端螺旋体Ess与之结合，可增强该抗原的免疫源性。

②抗体。主要有两类，即IgM和IgG。1980年于恩庶等用2-巯基乙醇处理血清，对感染波摩那型钩端螺旋体毒力株的猪做了IgM和IgG抗体的调查，发现有3种抗体反应类型，第1种是早期为IgM，晚期至恢复期为IgG；第2种为早、晚期均为IgM；第3种为早、晚期均为IgM，但在感染过程中某一个短暂阶段出现一过性的IgG。作者认为该3种抗体反应类型则与抗体原来的免疫状态有关，即无免疫力的机体受感染时，主要为第1种反应类型，有免疫力的机体再受感染时，常出现第2种或第3种反应类型。

Faine强调抗体是钩端螺旋体抗感染的重要因素。他认为抗感染依赖B细胞参与的免疫球蛋白。用免疫抑制药环磷酰胺处理对钩端螺旋体无感染性的BALB/c小鼠，继用波摩那型钩端螺旋体进行感染，结果小鼠不产生抗体而死于感染。Banfi、Cinco先后指出，巨噬细胞仅当特异性抗体存在时，方有杀灭钩端螺旋体的作用。

③补体。补体能促进特异性抗体溶解相应的微生物。1983年Cinco等以11株腐生性及10株致病性钩端螺旋体进行研究，结果证实致病性及腐生性钩端螺旋体对补体的敏感性不同，前者抵抗补体的杀灭作用，而后者则敏感；前者激活补体能力弱、后者通过旁路途径激活补体，致使钩端螺旋体被消灭。

（2）细胞免疫：在细胞免疫过程中，起重要作用的免疫细胞有多型核白细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。

①中性粒细胞。1984年王伯瑶等以腐生性钩端螺旋体Fatocl株与致病性钩端螺旋体23581株作为实验菌株，观察多型核白细胞对钩端螺旋体的防御作用。结果表明腐生性钩端螺旋体与10%正常人血清作用1h后、99%钩端螺旋体被杀死，而致病性钩端螺旋体以1%或10%正常人血清作用1h后不被杀死；腐生性钩端螺旋体与多型核白细胞37℃混合培养，后者对腐生性钩端螺旋体（未加血清）和致病性钩端螺旋体（加10%正常血清）均无吞噬和杀灭作用；腐生性钩端螺旋体与多型核白细胞离心沉淀后培养，后者能杀死93%的腐生性钩端螺旋体（未加血清），而致病性钩端螺旋体（加正常血清）虽被吞噬，但不被杀死；钩端螺旋体与多型核白细胞一起孵育（未加正常血清），腐生性钩端螺旋体被多型核白细胞吞噬，致病性钩端螺旋体即使加10%血清，仅黏附于细胞膜上，不被吞噬。

上述结果说明，在无特异性免疫的宿主血清中，多型核白细胞对致病性钩端螺旋体既不能吞噬，也不能消灭。因而认为特异性抗体在防御钩端螺旋体感染时，为一种重要的宿主防御因子。

②巨噬细胞。宿主的巨噬细胞对钩端螺旋体的防御作用，说法不一。1964年Faine观察小鼠、豚鼠和家兔的巨噬细胞及中性粒细胞对黄疸出血型钩端螺旋体的吞噬作用，在免疫的及未免疫的动物之间其吞噬能力无差别，从而强调体液免疫的作用。1982年Banfi的研究表明，有毒力的钩端螺旋体株用相应的抗血清处理后，能被豚鼠巨噬细胞吞噬。在电镜下见到巨噬细胞的吞噬空泡中含有大量变性并溶解的钩端螺旋体。这说明在有抗体调理时，能吞噬和杀死所吞噬的钩端螺旋体。1984年范纪劳将经钩端螺旋体免疫的小鼠巨噬细胞转输给同种小鼠，能特异地抵抗钩端螺旋体免于死亡，而未免疫的小鼠巨噬细胞则不能。1986年Isogai等给免疫的或未免疫的小鼠静脉内注射硅悬液，结果增加了它们对钩端螺旋体感染的敏感性；如无特异性抗血清，巨噬细胞也能吞噬并杀死钩端螺旋体，不过这种活力很低；在有特异性抗血清时，无论是体内还是体外试验结果，都能增加巨噬细胞的吞噬作用。

综上所述，钩端螺旋体感染组织中的巨噬细胞吞噬该微生物并将其杀死；特异性抗体能加强巨噬细胞对钩端螺旋体的吞噬。

③淋巴细胞。淋巴细胞对钩端螺旋体病的免疫作用尚不清楚。1982年Bey等观察到淋巴细胞反应趋势与体液反应相似，认为淋巴免疫系统在清除肾感染钩端螺旋体方面似乎是重要的。1981个姚楚铮等用赖型钩端螺旋体免疫小鼠腹腔渗出细胞、巨噬细胞、T和B细胞转输给经环磷酰胺处理的小鼠，具有程度不同的抗同型钩端螺旋体感染的作用，其中以B细胞的作用最显著。

（3）宿主的防御机制：上述研究充分说明，宿主对钩端螺旋体的防御机制是细胞免疫与体液免疫相互结合、相互影响和相互制约。侵入机体的致病性钩端螺旋体首先被巨噬细胞吞噬，被吞入细胞内的钩端螺旋体抗原性明显提高，且与巨噬细胞自身的Ⅰa抗原结合成为复合抗原，后者刺激TH，继而将抗原信息传递给B细胞，转化为浆细胞后产生特异性抗体，这些特异性抗体的Fc段一方面与巨噬细胞表面的Fc受体结合，成为有杀伤力的免疫巨噬细胞，具有强大的溶解及杀伤钩端螺旋体的能力；另一方面特异性抗体Fab段与钩端螺旋体细胞表面受体结合，发挥调理作用。钩端螺旋体经特异性抗体调理后，降低了表面电荷，使钩端螺旋体易黏附于巨噬细胞表面，尤其是肝、胆等组织器官中的巨噬细胞，从而更易使巨噬细胞将钩端螺旋体摄入并加以消灭。因此，细胞免疫与体液免疫相辅相成，表明这两种免疫功能对钩端螺旋体病同等重要。

2．疫苗发展简史 钩端螺旋体疫苗（leptospira vaccine）的制造和应用创始于日本，1916年Ido等首次试制钩端螺旋体疫苗，按其发展过程可分为普通疫苗和浓缩疫苗两个时期。

我国自1958年由魏曦等按照苏联《钩端螺旋体疫苗制造及检定规程》所述方法试制成功了普通疫苗。我国钩端螺旋体疫苗生与应用虽然起步较晚，但发展较快，逐步形成了有我国特色的生产方式和工艺流程。我国生产的钩端螺旋体疫苗主要是普通疫苗，但也有少量浓缩疫苗。我国疫苗的发展过程，经历了蒸馏水疫苗时期、胎盘浸液疫苗时期、综合培养基疫苗时期。

1970年鄂未远等首先研制成功26号综合培养基，并于1970年用于疫苗生产。综合培养基的优点是不含蛋白质，无变应原性，配制方便，成本低廉，适于大罐生产。进入20世纪80年代后，综合培养基的研究又取得重大进展。如李世政等研制的847培养基和张锦麟等研制的C70培养基，其钩端螺旋体菌生长浓度均比原综合培养基提高3～10倍，使我国综合培养基的研究与应用发展到了一个新水平。该疫苗的预防效果，经30年广泛应用的结果证明，接种反应轻微，保护效果良好。

在这一时期，除综合培养基的研制、改进与应用取得重大进展外，在生产技术方面进行了两项重大改革，使我国疫苗生产提高到了一个新阶段。一项是采用中空纤维超滤浓缩取代现今各国使用的高速离心法，用于浓缩疫苗的制造。该方法的优点是过滤速率快，菌体损失少，还可为今后进一步采用连续培养生产法奠定基础。另一项是利用管道系统进行种子培养物接种、培养、合并与分装等工序的连续作业，从而可使大规模生产出高质量的钩端螺体疫苗成为可能。

3．疫苗设计原理 由于钩端螺旋体流行的血清型别十分复杂，各地流行的血清型别各不相同，钩端螺旋体疫苗的制造与应用应以各地流行病学和病原学调查的结果为依据，密切配合，互相协调。因此，在不同地区应选择符合当地流行的血清型菌株用于疫苗制造，以保证疫苗的免疫效果。在众多血清型感染的地区，毋须采用所有的血清型别来制造多价疫苗，一般应根据当地各血清型菌株的相对检出率及各血清型钩端螺旋体在临床上所引起症状轻重的程度，或者使牲畜在经济上所造成损失的大小来确定所应选择的血清型及其在成品疫苗中的合理配比，使采用的血清型数减至必要的最低限度而又可赋予人群和牲畜足够的免疫力。

4．疫苗菌株的选择 应选择当地主要流行菌型的钩端螺旋体菌株，从该菌株具有良好的抗原性、免疫源性和应有的毒力，这是钩端螺旋体疫苗生产菌株选择的基本原则，具体要求如下。

（1）疫苗生产菌株应具有典型的形态、运动活泼、能在疫苗生产培养基中良好生长。

（2）疫苗生产菌株的血清型别应采用显微镜凝集试验和凝集素交叉吸收试验检定。

（3）疫苗生产菌株应具有良好的血清学特性。用标准血清作显微镜凝集试验时其凝集滴度应达到原血清效价之半。

（4）疫苗生产菌株应具有良好的抗原性。用培养5～10d，每视野（100倍）70～100条、经56℃加温1h杀死的培养物，静脉免疫2～2.5 kg的健康家兔3只，各按1、2与5m1，注射3次，间隔5d，末次注射后10～15d，取家兔血清与同株培养物作凝集反应，至少应有2只家兔血清效价达到1∶10 000以上判为合格。

（5）疫苗生产菌株还应具有良好的免疫源性。所选择的菌株不仅对用同型菌株攻击有最好的保护效果，而且该菌株具有较广的抗原谱，有一定的交叉保护。

（6）疫苗生产菌株亦应具有一定毒力。不仅因生产菌株与疫苗的效力检定需要用有一定毒力的菌株来攻击，而且如Borg-Petersen曾证明的黄疸出血型有毒菌株制造的死疫苗，其最小保护量比用无毒力的同型菌株制造的死疫苗约高1 000倍。因此，菌株的毒力测定应是疫苗生产菌株选样观察的项目之一。

5．疫苗的检定 在疫苗制造的全过程中，应按疫苗制检规程的各项要求进行检定，以保证制品的质量和人群使用的安全与有效。因各国疫苗的生产方式与制造条件的不同，在检定内容与方法上也有所差异，但基本原则与要求应是一致的。现就我国钩端螺旋体疫苗的检定要求简述如下。

（1）无菌试验：是保证疫苗质量与正常生产的重要检测方法，应贯彻在疫苗制造的全过程。从种子培养物开始，对用于疫苗制造的每一代培养物、半成品与成品疫苗均需按《生物制品无菌试验规程》要求进行无菌试验。

（2）理化检测：制成的成品疫苗应为微带乳光的液体，不应变色，无异臭，无摇不散的凝块及异物。疫苗的菌体浓度应符合要求。pH应为6.4～7.4。氯化钠含量应为7.5～9.5g/L，苯酚含量不超过2.5～3.5g/L。

（3）异常毒性试验：按《生物制品异常毒性试验规程》进行。异常毒性试验应进行小鼠和豚鼠两种动物进行。试验用的小鼠和豚鼠应达到清洁级标准。小鼠试验，采用体重18～22g健康小白鼠，每批样品5只，每只腹腔注射疫苗0.5m1，观察7d，小鼠应全部健存，无异常反应，体重增加，判为合格；豚鼠试验，采用体重250～350g健康豚鼠，每批样品2只，每只豚鼠腹腔注射5ml，观察7d，豚鼠应全部健存，无异常反应，体重增加，判为合格。

（4）效力试验：按成品疫苗所含菌型价数检定。用生理氯化钠溶液将疫苗稀释成每毫升剂型含菌数0.5亿条的疫苗免疫体重为120～220g豚鼠3只（对照组3只应同时饲养），皮下免疫2次，第1次0.5m1、第2次1m1，间隔5d，末次注射后10～12d，用同株或同型异株培养5～10d，每视野50～100条，400×的培养物2m1皮下攻击。

强毒株，攻击后观察10d，免疫组豚鼠应健在，外观及食欲正常，不耸毛，运动活泼，体重增加，解剖无黄疸，对照组豚鼠至少应有2只钩端螺旋体病死亡，判为合格。

弱毒株，攻击后24h抽取心血，分别接种2管5%～10%兔血清培养基，每管1或2滴（约为1%接种量），培养14d。免疫组心血培养2/3以上阴性，对照组均为阳性，判为台格。

（5）鉴别试验：采用反向间接炭凝集试验，按成品疫苗所含菌型价数与相应炭血清做炭凝集试验，应产生特异性凝集。

6．疫苗的应用 钩端螺旋体疫苗是供作钩端螺旋体病特异性预防的一种生物制品。

（1）疫苗的种类

①菌体疫苗。菌体疫苗系用我国各地主要流行的钩端螺旋体菌型的菌株，经培养浓缩后，用苯酚杀菌，按型别配制成单价或多价疫苗。5价以下（含5价）每型含菌数不低于1.5亿/m1，各型配合比例，不应超过或低于计算量的10%。6价以上每型含菌数不应低于1亿/m1。但疫苗的总菌数不应超过12.5/m1，疫苗的理化检查应为微带乳光液，不应变色，无异臭，无摇不散的凝块和异物。无菌试验、安全试验合格。效力试验按成品疫苗所含菌型价数检定，每型含菌数应在0.5/m1以上。反向间接血凝滴度均应达到1∶16以上。

②菌体外膜疫苗。钩端螺旋体外膜疫苗系采用各地不同流行型别菌株，经分别培养浓缩后，用十二烷基硫酸钠分离提取外膜抗原，按需要的型别，配制成单价或多价外膜疫苗。疫苗为微浑略带乳光液体，不应有变色或摇不散的凝块及异物。

（2）接种对象：重点流行地区7～60岁人群应注射本疫苗。一般流行地区易于与污染水源接触的人员，例如参加播种、插秧、秋收、排涝、开荒人员等。疫区的水道工人、屠宰工人、肉食品加工工人等，可根据当地疾病流行情况考虑接种。

（3）使用方法

①注射部位：臂外侧三角肌附着处皮肤经消毒后皮下注射。

②注射剂量及间隔：成人第1针0.5ml，第2针1.0ml，间隔7～10d。7～13周岁剂量减半。必要时7周岁以下儿童酌量注射，但不超过成人剂量的1/4。1年后加强1针，剂量同第2针。

【疫苗接种后的免疫效果】

机体经免疫后，能够产生对再次感染钩端螺旋体的特异性免疫反应，其抗体通过凝集作用凝集和溶解病原体，从而迅速清除血液中的钩端螺旋体。一般对同型菌可产生较好的免疫性，所以使用的疫苗只要与当地流行的菌型一致，一般能降低发病率，并能减轻临床症状。接种疫苗后人体产生的免疫力可维持1年左右。

【疫苗接种的禁忌证与不良反应】

1．禁忌证

（1）发热，急性传染病。

（2）严重心脏病，高血压、肝、肾疾病。

（3）神经及精神疾病。

（4）有过敏史者。

（5）妊娠期，哺乳期妇女。

（6）月经期妇女暂缓注射。

2．接种反应 疫苗注射后全身及局部反应轻微。通常在局部引起红晕、浸润、紫斑，个别人出现硬结。据观察表明，24h局部弱反应占8.29%，中反应占5.86%，48h后明显减低。偶有发热，多在注射后24h出现，轻度发热反应仅占2.44%，48h后消失。一般第1针注射反应频率高于第2针。极少数人可有头晕、头痛、乏力、恶心等全身症状，但均较轻微，不需特殊处理即可自行恢复。我国早期使用的疫苗，由于在培养的过程中含有动物血清或胎盘浸出液，因此常引起变态反应的报道。但目前采用综合培养基培养，因此极少发生。

3．注意事项

（1）安瓿内有摇不散的凝块、异物或疫苗变色，曾有冻结、安瓿有裂纹等均不能使用。

（2）必须全程足量接种2针，否则会影响效果。

（3）应备有1∶1 000肾上腺素，供偶发过敏性休克时急救用。

（4）于2～8℃贮运，自杀菌之日起有效期1年半。

【相关疫苗接种不良反应处理】

免疫接种所用的生物制品无论是抗原还是抗体，对人体而言都具有抗原性，都是大分子的异种或异体物质。接种于人体后，除产生有益的免疫反应外，有时还可能因为生物制品质量、使用方法或极少数人处于某种特定的病理生理状态及特有的遗传素质，产生有损于机体的不良反应或免疫反应（变态反应）。

在数以亿计的接种对象中，免疫接种的不良反应是极其少见的，而且多是轻微的。但仍有一些与免疫接种相关的不良反应需要去认真分析处理，既不要把一些适逢在免疫接种时耦合的病症误诊为接种不良反应而延误对疾病的治疗，又不要把真正的接种不良反应排除，忽视了与免疫接种的关系，这也不利于免疫实施及生物制品质量的改进。

1．一般反应及处理 一般反应是在免疫接种后发生的，由生物制品本身固有的特性引起，对机体只会造成一过性生理功能障碍的反应。一般反应分局部和全身反应两类。

（1）无论是局部还是全身反应都无需特殊处理，注意适当休息和保暖，多饮开水，防止继发其他疾病。

（2）对较重的局部反应，可用清洁毛巾热敷，每日数次，每次10～15min。可以帮助消肿，减少疼痛。

（3）较重的全身反应，可用解热镇痛药等对症处理。

2．异常反应及处理

（1）局部有菌性化脓性感染：可能是由于疫苗或注射器被污染，或注射器材和皮肤消毒不严所致。主要表现为注射局部红、肿、热泪盈眶、痛的炎症表现。脓肿大多表浅，可伴有全身疲乏、头痛、发热等症状。脓肿局限后，中央部位较软，可有波动感。

在有菌化脓的早期可用热敷或外敷鱼石脂软膏；脓肿形成后可切开排脓；全身症状者使用抗生素或其他对症治疗。

（2）过敏性休克：过敏性休克是由致敏原引起的一种严重的以周围循环衰竭为主要特征的症候群，发病呈急性过程，一般在输入抗原后即刻或数分钟至半小时内发生。出现胸闷、气急、面色苍白和呼吸困难等，甚至由于喉头水肿、支气管平滑痉挛，而导致四肢发冷、脉搏细弱、血压下降、昏迷等一系列严重症状，如救治不及时可致死亡。

过敏性休克的预防主要是在使用疫苗前详细询问病史，凡有过敏史者不应注射。发生过敏性休克要及时处理：①让病人平卧，头部放低，注意保暖。②立即肌内注射1∶1 000肾上腺素0.5～1.0ml（必要时可静脉注射），同时肌内注射苯海拉明25～50mg。以上两种药物应用10min后再注射1次。③为防止组胺的释放，可给予氢化可的松300～500mg/d，或地塞米松20～40mg加入葡萄糖生理盐水中静滴。④病情严重用肾上腺素后血压仍不升高者，可用去甲肾上腺素1～2ml加入5%葡萄糖生理盐水中静滴。⑤呼吸衰竭者可肌内注射洛贝林30mg或尼可刹米250mg，同时吸入氧气，有喉头水肿者可进行气管切开。

【问题与展望】

1．新疫苗的研究

（1）外膜疫苗（outer membrane vaccine）：是我国学者首先研制成功，可用于人群钩端螺旋体病预防的新疫苗。1980年鲍行豪等首先开始研制，经过各种试验分析，动物实验和人群临床反应和血清学效果观察，结果满意。在此基础上，上海生物制品研究所又做了改进，进一步提高了质量，并经过国家新药审评通过。获取了新药证书和生产文号、1998年陈均福等使用赖型和七日热双价疫苗对81 458名疫区成人进行预防接种，观察疫苗的接种反应和流行病学效果。结果证明，该疫苗接种反应轻微，未见严重异常反应，赖型抗原的保护效果是96%，七日热型抗原的保护效果是100%，效果很好。

（2）核酸疫苗：1999年游自立等对赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白在动物体内的表达及其免疫保护进行了研究。采用PCR扩增内鞭毛蛋白编码基因，以表达质粒VR1012为载体。构建了含有钩端螺旋体内鞭毛基因的重组质粒；在每只新西兰大白兔四头肌内每次注射该重组质粒DNA 500 µg，重复3次，每次间隔3周，于每次注射前和末次注射后3周，检测血清抗赖型钩端螺旋体抗体滴度。结果显示，第1次加强免疫后3周，试验组血清抗体滴度显著增高。豚鼠免疫保护试验，每只豚鼠的免疫剂量如前，用赖型强毒株017株6亿菌攻击。结果表明，较无佐剂条件下试验组存活率为90%（9/10）。

（3）重组蛋白质疫苗：江南等用地高辛标记的含完整外膜蛋白质L1结构基因的L. alstoni 2.5kb EcoRl重组DNA探针与自行构建的黄疸出血型017株基因库重组质粒pDJH2进行DNA-DNA杂交。结果证实，该重组DNA探针与pDJH2 1.9 kb插入片段同源。使用IPTG诱导重组质粒pDJH2后，其在大肠杆菌中表达了相对分子质量为68 000的产物。经蛋白酶K消化、免疫印迹及斑点酶联免疫吸附试验，证明该产物属钩体外膜蛋白质。经免疫学证实只有良好的免疫源性。

2．疫苗的评价与展望 总结我国钩端螺旋体疫苗40余年来的发展历程，在疫苗生产、使用和研究等方面均取得了显著成绩。根据我国钩端螺旋体病防治的实际需要，坚持走我国钩端螺旋体疫苗的发展道路，为世人所注目。目前我国钩端螺旋体疫苗的生产已发生根本性变化，无论生产规模还是生产工艺均属世界一流。其中特别值得指出的是疫苗生产培养基的不断改进和应用，采用深层通气培养法进行培养，疫苗合并大罐化和分装连续化，不仅提高了产量，降低了劳动强度，提高和保证了质量，而且为今后发展连续培养和生产流程自动化及连续化奠定了基础。

目前，我国生产的钩端螺旋体疫苗，虽然以普通疫苗为主，但其所含菌体浓度已达到国际浓缩疫苗的水平。尤其近年来，如武汉生物制品研究所采用中空纤维超滤纯化生产钩端螺旋体疫苗，又使疫苗质量得到提高。

新型疫苗的研制，无论是外膜疫苗还是核酸疫苗与重组蛋白质疫苗，均取得积极成果。尤其外膜疫苗已完成了实验研究，新药申报，现场Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床观察，获取了新药证和生产文号。这为我国钩端螺旋体病疫苗有效预防增添了新制品。

但是，钩端螺旋体疫苗仍有一些问题尚待解决。

（1）综合各国钩端螺旋体疫苗研制现状，无论是现用的死疫苗还是纯化疫苗，虽各有特点，但其共同的弊端是免疫力不够强和持久及群型的保护面不广。然而这些又是难以解决的问题，展望未来，今后唯有阐明抗原决定簇后，从基因工程或从抗独特型抗体上谋求出路。

（2）家畜钩端螺旋体病的预防在我国尚未引起充分注意，至今尚无正式的钩端螺旋体兽用疫苗生产。家畜钩端螺旋体病不仅是人类钩端螺旋体病的重要传染源之一，而且在农牧业经济上也有其重要意义。可以预期，随着国民经济的发展，兽用疫苗将会受到重视，其应用范围将会得到不断扩大。