体外特异性诊断法

所谓体外特异性诊断法是指从受试者体内采集血液或其他体液，在实验室里进行实验检测的方法，患者只需提供检测样本，其他试验过程均在患者体外进行。体外特异性诊断的目的是：明确患者是否是Ⅰ型过敏体质或Ⅰ型变态反应病，并找出患者的过敏原。

与体内试验相比，体外诊断法最大的优点是对患者安全。因体内试验是在患者体内进行的，所观察的现象是患者体内反应的结果，总是存在万一发生强烈过敏反应的风险。而用体外试验检测过敏原特异性IgE只需要少量血清即可进行多种过敏原检查，结果准确，可定量或半定量。不受患者服用药物的影响，对患者几乎没有皮肉痛苦，患者乐于接受，尤其适合于儿童、有弥漫性皮疹和严重过敏反应而药物治疗不能中断者。目前各种检测过敏原特异性IgE的仪器已广泛应用于医院的临床检验实验室。这些仪器采用的实验方法都是以免疫酶技术为基础，可检测的过敏原项目包括吸入性、食入性、接触性、注入性等不同类别数百种之多。其主要缺点是试剂价格昂贵，患者往往难以承受。某些小分子过敏原（如药物、化工原料等）难以制成体外诊断试剂用体外方法进行检查，检测过程需要一定时间（数小时至1d），而皮肤试验只需15min就可获得结果。

为诊断过敏原而进行的体外特异性诊断试验分为细胞学实验和血清学实验两类，细胞学实验以血细胞作为检测样本，血清学实验以血清或其他体液为检测样本。

一、检测样本

1．全血　抗凝血中含有完整的血细胞，其中的嗜碱性粒细胞是检测对象。

2．血清　过敏体质者的血清中含有针对过敏原的特异性IgE或IgG，可通过检测血清中这些特异性抗体的水平来判断患者对哪些过敏原过敏。

3．其他体液　过敏体质者的不同反应性炎症部位分泌物（激发试验分泌的鼻分泌物）、渗出物（皮窗渗出物）、灌洗液（支气管肺泡灌洗液）等炎症局部部位的体液中含有较高浓度的特异性抗体，可用于进行特异性诊断。

二、检测项目

1．细胞学实验　包括嗜碱性粒细胞脱颗粒试验和嗜碱性粒细胞组胺释放试验。

（1）原理：两种实验的原理大致相同，都是根据嗜碱性粒细胞活化脱颗粒的原理而设计的。当变应原初次进入体内，在抗原递呈细胞作用下浆细胞产生变应原特异性IgE。IgE分子与嗜碱性粒细胞表面的IgE受体结合而固定在细胞表面。当结合有变应原特异性IgE的嗜碱性粒细胞与再次进入体内的变应原相遇时，嗜碱性粒细胞会由于IgE分子的桥联反应而被活化，活化的嗜碱性粒细胞将胞浆颗粒排出称为脱颗粒，并同时释放组胺。

（2）方法：嗜碱性粒细胞脱颗粒试验的方法是：采集患者抗凝血，分离白细胞悬液（含嗜碱性粒细胞），加入可疑变应原，在37℃条件下体外混合温育30min，然后直接在显微镜下观察嗜碱性粒细胞脱颗粒的情况。结果判断以计数脱颗粒细胞＞30%为阳性。

组胺释放试验的方法与嗜碱性粒细胞脱颗粒试验大致相同，只是在加入可疑变应原混合温育后加入苯乙甲醛，该试剂可与从嗜碱性粒细胞中释放的组胺发生缩合反应，用荧光分光光度计测定培养上清液的吸光度值，计算出组胺浓度，对组胺进行定量检测。结果判断以组胺释放率＞15%为阳性。

（3）结果分析与临床意义：阳性实验结果提示所加入的可疑变应原是该患者的过敏原。这两种实验由于操作较为繁琐，一般不用于临床常规检查，只用于对特殊过敏原的鉴定。有些少见过敏原不包括在常规体内试验和体外试验的商品试剂种类中，可用上述细胞学方法进行诊断。

2．血清学检查　以患者血清作为实验材料的体外试验方法称为血清学试验。其他体液如炎症部位分泌物（激发试验分泌的鼻分泌物）、渗出物（皮窗渗出液）、灌洗液（支气管肺泡灌洗液）也可采用相同的实验方法进行检测。主要检测项目有总IgE和特异性IgE，即过敏原特异性IgE。

（1）总IgE：IgE即免疫球蛋白E，是Ⅰ型变态反应病发病机制中起主要作用的免疫分子，因而在过敏反应的免疫学实验诊断中是首选的检测项目。总IgE是过敏性疾病的特异性检查项目，IgE水平增高提示Ⅰ型变态反应病的可能性大，但不能用于判断过敏原。

①IgE的特点：IgE是血清浓度最低的免疫球蛋白，只有血清中IgG浓度的万分之一。IgE对热不稳定，是半衰期最短的免疫球蛋白，只有2．8d，与细胞表面结合的IgE半衰期稍长，8～14d。IgE由变应原入侵部位（鼻咽、支气管、胃肠道）的黏膜固有层中的浆细胞合成。在各类免疫球蛋白中，IgE是合成率最低、分解率最高的。属于亲细胞抗体（亲同种细胞抗体）。过敏体质者的胎儿脐带血中IgE浓度可能升高，检测脐血中IgE浓度可用于评估胎儿过敏体质的可能性。

②检测方法：通常用ELISA方法检测总IgE。由于血清IgE浓度很低，一般酶免疫试验方法的敏感性不足以检出血清IgE，现在常规实验室检测血清IgE的试剂盒采用生物素－抗生物素蛋白放大的ELISA。试剂盒中所含用于制定标准曲线的IgE标准品和检测结果的IgE浓度单位与其他免疫球蛋白不同，不是用mg／L表示，而是用U／ml或kU／L表示。1U＝2．42ng，相当于世界卫生组织（WHO）标准国际参考标准75／502的冻干血清制剂0．009　28mg内所含的IgE量。商品试剂盒的最低检出浓度为5～10kU／L，线性范围为5～500kU／L。

③IgE的正常值（参考范围）：血清IgE水平在正常人群中呈偏态分布，即多数人为0或接近于0，IgE水平越高的人数越少。因此计算平均值时应计算几何平均值才能反映其真实情况，即用对数转换后其分布才能近似正态分布。

IgE是体内异常情况下才出现的抗体，正常情况下应该不能检出IgE。而且IgE升高不一定是过敏反应，过敏反应者也不一定IgE升高。目前国内所应用的检测血清IgE的ELISA试剂盒多将150kU／L定为参考范围上限。实际上，血清IgE水平难以划定正常参考值范围，正常情况下应为0。但在临床实际工作中，划定血清总IgE水平参考值再结合患者临床表现有助于粗略地评估体内的过敏状况。一般商品试剂盒均附有“正常值范围”，所谓正常值仅为参考范围，并不是低于此值就一定是“正常”。每个实验室可根据所使用的试剂盒及实验条件提出参考值范围。在检测时须注意，每次检测必须同时有质控参考品以保证结果准确性。当结果超出标准曲线范围时，须将样本稀释后再次检测方能获得正确结果。

健康人群血清IgE水平与年龄关系较大，小儿和老年人的IgE水平低于成年人。种族、遗传因素及检测方法对IgE水平的检测结果也有影响。

新生儿血清中IgE水平很低，接近于零。随年龄增长，IgE水平也不断升高，5～7岁后接近正常人水平。按Pharmacia公司提供的参考范围（几何平均值加1SD）：1个月以内＜12kU／L，1岁＜11kU／L，2～4岁＜33kU／L，5岁以上至成人＜85kU／L。

过敏性疾病患者的血清IgE水平可达2　000～8　000kU／L。当IgE水平高于2　000kU／L时应考虑寄生虫感染。

有时血清总IgE水平检测结果为0或参考范围内低值，并不能排除过敏性疾病的可能，须结合临床表现和血清特异性IgE检测结果进行判断。

（2）特异性IgE检测（sIgE）：通常所称的过敏原检测，并非真正检测血液样本中的过敏原分子，而是间接地检测其中针对某种过敏原的特异性IgE分子。特异性IgE检测实际上是检测过敏原特异性IgE，即检测样本中针对某种变应原的特异性IgE，从而间接地判断患者是否对某种过敏原过敏。

根据世界卫生组织的指导性文件，对过敏性疾病最主动的治疗措施就是明确过敏原。为了减少、减轻疾病的发作，有针对性地回避过敏原是最好的办法。

环境中能够成为过敏原的物质有成百上千种，包括吸入性、食入性、接触性、注入性等各种途径进入体内的小分子抗原性物质。每个过敏体质者的过敏原由于遗传素质的差异可能有所不同，因此每个过敏性疾病患者或过敏体质者进行过敏原检测对于病因诊断、免疫治疗及预防都有重要意义。

过敏原的检测方法分为体内试验和体外试验两大类。体内试验方法已在上节介绍。

sIgE检测是目前最常用的诊断过敏原的体外实验方法。嗜碱性粒细胞脱颗粒试验和组胺释放试验只在某些特殊情况下才使用。

环境中能引起Ⅰ型变态反应的物质即过敏原有很多种，每种过敏原都能使对其过敏者体内产生过敏原特异性IgE。血清中特异性IgE的水平可反映个体对何种过敏原过敏及过敏的严重程度。由于血清特异性IgE水平比血清总IgE水平更低，需要应用敏感性更高的专门仪器设备进行检测。早先检测过敏原特异性IgE的方法是瑞典Wide等于1967年建立的放射性变应原吸附试验（radio－allergosorbent test，RAST）。为了避免放射性物质的污染，近年有多种商品化的方法应用于检测过敏原。如免疫荧光－酶技术（fluorescence－enzyme immunoassay，FEIA）、化学发光技术（chemiluminescence）等。免疫荧光－酶技术又称荧光－酶免疫检测法或酶促荧光放大技术，是定量检测样本中微量蛋白的方法。β－半乳糖苷酶的底物：4－甲基伞桂－β半乳糖苷，其中含有荧光物质。检测血清或其他样本中变应原特异性IgE的敏感性可达0．35kU／L。以免疫印迹原理为基础和免疫层析原理为基础的半定量检测sIgE的方法敏感性较FEIA略低，由于相对价格比较低廉且能基本满足临床需要，现被广泛应用。体外血清学试验只需要少量血清即可进行多种变应原检查，结果准确，可定量或半定量，不受药物影响，对患者安全，痛苦小，易于为儿童接受。Pharmacia公司的CAP系统现多被公认为检测sIgE的敏感性和特异性都较好的实验方法，其缺点是试剂及相应仪器价格都过于昂贵。故对不同患者可根据实际情况选择体内试验或不同的体外试验方法。实验过程及报告时间需数小时至一天，某些小分子过敏原（药物、化工原料）尚无体外过敏原检测商品试剂，也难以用常规方法进行检查。

环境中常见的过敏原包括以下类别。

寄生虫和微生物：各种螨类（屋尘螨、粉尘螨等）、各种真菌（点青霉、烟曲霉、分枝孢霉、交连孢霉等）、蟑螂。

植物花粉：各种草花粉（豚草、葎草、蒿草）、各种树花粉（桑树、柏树、悬铃木、桦树、榆树、栎树、柳树、杨树等）。

动物毛屑：猫、狗、马、鸽子等动物的毛和皮屑。

食物：鸡蛋白、牛奶；鱼、虾、蟹等水产品；扇贝等海产品；牛肉、羊肉等肉类；腰果、蚕豆等豆类；花生、核桃、开心果等坚果；芒果、菠萝、西红柿、猕猴桃等瓜果；芹菜、菠菜、花椰菜等蔬菜；小麦、荞麦等谷物及其他多种食物。

药物：青霉素等抗生素、非甾体抗炎药。

接触类物质：乳胶、油漆、洗涤剂、金属（镍、钴、铬、金）等。

化工材料：甲醛、柴油颗粒等。

现在商品化的特异性IgE种类已达数百种之多。大多数患者是对常见过敏原过敏，所以商品化的试剂盒中将各种过敏原分类组合，能满足大多数患者检查过敏原的需求。

特异性IgE的参考值及临床意义：不过敏者应＜0．35kU／L。按照血清sIgE的浓度，分为7级（表3－1）。级别越高，过敏程度越严重。

表3－1　特异性IgE的分级标准

（3）过敏原特异性IgG4：IgG是人体内含量最高的免疫球蛋白，能通过胎盘，广泛存在于血液和组织液中。大多数抗体活性来自IgG。根据γ链抗原性的差异IgG可分为4个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，各亚类含量分别占IgG总量的65%、23%、8%、4%（16∶6∶2∶1）。有些过敏体质者在接触某些过敏原时，尤其是在食用某些食物后出现过敏反应，产生针对该变应原的特异性IgG4抗体。肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面也有IgG4受体，因此IgG4与IgE相似，亦可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合发生脱颗粒效应，但其引起的过敏反应效应比IgE所引起的过敏反应轻微。这些患者血清中不能检出变应原特异性IgE，而针对该食物的变应原的特异性IgG4水平增高。IgG4介导的过敏反应一般出现较慢，约在食入过敏原数小时或数天后才发生，主要表现为皮疹或皮肤水肿。IgG4的分子结构与IgG1有些差异，其功能也较复杂。有些非过敏性疾病也会出现IgG4明显增高，如肠道寄生虫病、自身免疫性胰腺炎等。现在检测过敏原特异性IgG的商品化酶免疫试剂盒较多，但检测过敏原特异性IgG4的商品试剂盒较少。检测IgG的试剂盒所检测的是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的混合物，其阳性结果一般称为食物不耐受而不称为食物过敏，也可能和多种其他疾病有关，如肠易激惹综合征、皮疹、偏头痛等。过敏原特异性IgG4的检测对过敏性疾病的诊断较有意义，属于特殊类型的过敏反应。

参考值：过敏者过敏原特异性IgG4＞0．7g／L（ELISA法）。小儿由于总IgG水平较成人低，IgG4阳性水平亦较成人低。

（4）补体：补体是体内一类具有酶活性的蛋白，在机体非特异免疫中发挥重要作用。一般临床实验室常规开展的补体检查项目有：总补体溶血活性（CH50）、旁路途径溶血活性（APH50）、单个补体组分（C3、C4）。在有免疫复合物参与的Ⅲ型变态反应中补体发挥重要作用，其血清水平会表现出明显变化，而在IgE介导的Ⅰ型变态反应中，这些项目并无明显异常。但是补体活化后产生的裂解产物C3a、C5a，补体活化的抑制因子C1抑制物在过敏性疾病的诊断中具有重要意义。补体不参与IgE介导的Ⅰ型变态反应，但在体内有免疫复合物参与的其他免疫反应中，补体组分C3和C5活化的裂解产物C3a和C5a具有很强烈的血管活性作用。肥大细胞表面有C3a和C5a的受体，大量C3a和C5a能使肥大细胞活化，引起局部水肿，因而称为过敏毒素。在蛇毒、蜂毒等昆虫毒素引起的过敏反应中，C3a和C5a是引起病理改变的主要炎性介质。补体第一组分C1的抑制因子C1inh具有抑制补体过度活化的功能。有些患者由于先天性C1inh缺乏，可发生一种遗传性疾病——遗传性血管神经性水肿（HAE），表现为急性发作的全身及喉头水肿。C3a、C5a和C1inh都有商品化的抗体试剂或试剂盒供应，常用速率散射比浊法或ELISA进行检测，试剂盒说明书附有参考值范围。正常血清C3a的水平为100～1　000μg／L，C5a水平为1～10μg／L。正常血清C1inh水平为0．15～0．30g／L，低于参考值50%为异常。