动脉粥样硬化的实验研究

一、动物实验

动脉粥样硬化是多种心血管疾病的病理基础，其危险因素、发病机制及防治一直是医学领域内的重要研究课题。随着医学科学的发展，各学科的相互渗透，在整体动物实验水平方面进行了大量的工作。

动脉粥样硬化是脂质和纤维成分在动脉内膜聚集的慢性病理过程，研究动脉粥样硬化疾病的发病机制，离不开动脉粥样硬化动物模型。研究并建立可靠的动脉粥样硬化动物模型对于探明动脉粥样硬化的病因、发病机制及防治药物的研究与开发均具有重要的意义。

目前常见的建立动物模型的方法有：喂养法、机械损伤法、转基因法和免疫法。根据模型形成的方法和特征不同，可分别用于不同的研究目的。喂养法建立模型比较符合人类饮食的特点；机械损伤法建立模型快速并且动脉粥样硬化的部位明确；转基因法建立的模型可系统性研究某个基因与动脉粥样硬化的关系；免疫学方法建立的模型可考虑开发疫苗用于预防和治疗此疾病。动物模型研究的不断发展，将会不断提高人们对动脉粥样硬化的认识水平，从而对其预防、发生、发展认识将有一个大的飞跃。

最常用的方法是胆固醇高脂饮食（喂养法）建立的动脉粥样硬化模型。该类模型常采用的动物有兔、鼠、猪、鸽、非灵长类。1969年，Thompson采用高脂饲料（含50%脂肪）喂养C　57BL／6J小鼠5周，最早建立了动脉粥样硬化小鼠模型，但该模型死亡率很高。1985年，Paigen等对此进行改进（脂肪含量降至15%，饲养时间延长至10周），该模型不仅具有明显的动脉粥样硬化病变特点，且死亡率大大降低，但动脉粥样硬化病变仅限于主动脉根部。

机械损伤法是利用机械外力造成动脉内膜的损伤为主，高脂饲料为辅的动脉粥样硬化动物模型，优点是建立模型比较快速，动脉粥样硬化的部位比较明确。主要有球囊扩张动脉损伤法和下丘脑弓状核损伤法。2001年，Joen等发现将充满生理盐水的塑料球囊导管自大鼠颈外动脉进入胸主动脉，向外拉至颈外动脉再进入胸动脉，反复3次，再喂以高脂饲料8周后，出现明显病理改变。给予大鼠高脂饲料和球囊损伤动脉可形成与人类动脉粥样硬化相似的较成熟动脉粥样硬化斑块模型。家兔颈总动脉经皮腔内血管成形术模型模拟了临床经皮腔内血管成形术过程，死亡率低、成功率高，为经皮腔内血管成形术之动脉阶段局部用药或转基因治疗实验首选模型。下丘脑弓状核损伤法，模拟了临床上因脑血管疾病损伤弓状核加重动脉粥样硬化的病理过程，是筛选治疗此疾病的理想模型。

转基因动物模型是近年较新兴的一种方法，为血脂代谢与动脉粥样硬化关系的研究提供了全新的实验体系，并取得了显著的成果。基因工程小鼠是采用基因工程技术将编码某一特定蛋白质的特殊等位基因缺失。HDL的重要组成成分是载脂蛋白A1（apoA1），1991年，美国Rubin等建立apoA1转基因小鼠成功，进一步证实高密度脂蛋白（HDL）确实对动脉粥样硬化的发生产生抑制作用。1992年Cheisa等成功培育出能产生apo（a）的转基因小鼠。1992年Mortimer等和1993年Spangler等分别培育出apoE转基因小鼠，对研究动脉粥样硬化的形成起了重要作用。目前，最广泛采用的基因工程小鼠动脉粥样硬化模型是载脂蛋白E（apoE）和低密度脂蛋白受体（LDLR）基因缺陷小鼠。这两个基因在脂质代谢中起着非常重要的作用。apoE是多种与脂蛋白摄入相关的LDLR基因家族的重要配体，apoE基因缺失导致酯化胆固醇颗粒的聚集。1992年，Plump等成功建立了apoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化模型，常规饲料饲养（含4．5%脂肪）即可出现严重的动脉粥样硬化病变，这很快成为动脉粥样硬化研究领域的强有力工作。ApoE－／－小鼠动脉粥样硬化病变处细胞类型如巨噬细胞、T细胞和平滑肌细胞等与人类近似。与饮食诱导的动物模型不同，apoE－／－小鼠，形成脂质条纹和纤维增生病变的时间较常规饮食组更快。该模型的主要缺点是其脂蛋白谱与大多数人群不同。小鼠胆固醇主要存在于极低密度脂蛋白（VLDL），而人类是LDL。研究发现，一旦缺乏LDLR或LDLR发生变异，人类出现进行性高胆固醇血症和心血管并发症。1993年，Ishib动脉粥样硬化hi等采用基因工程技术从胚胎干细胞中建立起LDLR－／－小鼠。予含10%脂肪的饲料饲养该种动物模型后，血LDL和VLDL增加，血清胆固醇较正常升高2倍以上。虽然常规饮食饲养的LDLR－／－小鼠并无动脉粥样硬化生成，但它有别于单纯饮食诱导的C57BL／6J小鼠模型，前者动脉粥样硬化病变具有延展性。与载脂蛋白E和LDLR缺陷小鼠的出现，寻找新的基因进行敲除或转染，使其更接近于人类动脉粥样硬化特点的各种基因工程小鼠动脉粥样硬化模型已经着手研究，但逆转人类动脉粥样硬化病变的研究仍是一个漫长过程。

近年来，肺炎衣原体（Cpn）在动脉粥样硬化形成过程中的作用受到关注，Cpn感染和动脉粥样硬化之间的关系已为血清流行病学、病理学和分子生物学等证实，但尚无直接证据阐明两者之间的因果关系。1999年，Hu等以CpnAR39鼻内感染低密度脂蛋白受权体缺乏鼠模型，结果表明在高胆固醇血症的基础上Cpn感染可加重动脉粥样硬化损伤。2000年，Muhlestein首先观察到对非高脂血症兔经导管直接在腹主动脉壁感染Cpn，2个月后，在注射部位及近胸主动脉端观察到动脉粥样硬化的损伤。此法建立的动物模型为我们提供了新的思路，可以从免疫学角度研究动脉粥样硬化的形成与治疗，并且在临床上可从检测病人血清相应抗原的抗体滴度来确定病因。现在人们开始考虑开发疫苗用于预防和治疗此病。

二、细胞水平的研究

内皮细胞（endothelial cells，EC）以及血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）培养成功，为细胞水平的研究创造了条件。

1．内皮细胞的培养　EC为血管内表面一层完整的单层细胞，介于血流与血管壁组织之间。它不仅是一种机械屏障，而且还具有物质转运、自分泌、旁分泌等多种功能，与人体的诸多生理、病理过程密切相关，其结构和功能异常在许多疾病，尤其是在心血管疾病的发生、发展中起着重要作用。

最早的EC培养模型是静态培养。静态培养是指细胞培养过程中免受血流动力学的影响。这种方法于1963年由Marugama首次报道，其后Jaffe等又进一步解决了EC的纯培养和鉴定问题，该方法现已得到广泛应用。目前还有流动培养模型。

在内皮细胞研究方面，较多的学者以各种动脉粥样硬化的危险因素进行对内皮细胞损伤的体内外的实验研究，LDL、正负电荷、纤维蛋白、过氧化脂质、尼古丁等均对内皮细胞有损伤作用，1989年国内外较系统地报告了过氧化脂质（LPO）损伤人内皮细胞的形态特点及某些功能性改变，之后不同研究还分别证明了HDL、维生素C、硒、SOD等对内皮细胞脂质过氧化损伤具有一定程度的减轻或保护作用。

2．血管平滑肌细胞的培养　平滑肌细胞（SMC）构成了哺乳动物动脉中膜，是动脉粥样硬化和再狭窄病变中的主要细胞成分之一，对血管壁的完整性和调节血管的紧张性起着重要作用。SMC能够从分化成熟的收缩表型转化为分化不成熟的合成表型，然后再分化为收缩表型，这种适应改变的出现可作为是对血管损伤的一种反应，包括明显的结构改变，如肌丝减少，大量内质网、高尔基体形成。同时细胞骨架蛋白和其他基因产物也有所改变。从而使细胞失去收缩活性，从中膜迁移至内膜，造成内膜增厚。SMC的活性及其细胞外基质的完整性，决定了斑块是否易于破裂，从而形成急性心肌梗死和静脉移植桥的闭塞。进行体外VSMC培养是研究动脉粥样硬化病变的重要途径。

细胞培养广泛应用于医学和生物学领域，是较为成熟的研究工具。组织培养工作始于20世纪初。1907年，Harrison创建了盖片覆盖凹窝玻璃的悬滴培养法，即在无菌条件下，采用淋巴液作培养液，培养蛙胚神经组织，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此建立了体外培养组织和细胞的基本模式。1957年，Dulbacco等改进了培养技术采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养液的方法，获得了单层细胞培养。至此，单层细胞培养便成了组织培养普遍应用的技术。SMC的培养直到20世纪70年代初才陆续有人报道。1971年Campbell采用胶原酶及胰蛋白酶消化法成功培养了胚鸡SMC，并研究了其细微结构。同年，Russell运用组织块法也成功培养了幼豚鼠主动脉SMC，培养至8周仍保持其SMC形态。VSMC的培养现已成为一项成熟的实验技术。

3．EC－VSMC联合培养　SMC和EC是构成血管壁的主要细胞成分，两种细胞间的相互调节和相互影响是血管壁自身结构稳定性得以维持的关键。建立EC－VSMC体外联合培养，即血管壁模型对研究动脉粥样硬化发病机制、血管壁生理及炎症反应等有重要意义，对于探讨两种细胞之间的旁分泌功能及相互作用发挥了重要作用。

Jones于1979年构建了第一个这样的联合培养模型：将鼠尾胶原经溶解后与培养基按一定的比例混合制成凝胶，平铺在已贴壁生长的平滑肌细胞表面，作为胶原支架并在其上种植EC。实验中观察到，胶原支架上的EC生长良好且贴附生长的时间明显延长。尽管Jones在实验中取得了一定的成功，但模型中两种细胞还是不易分离做单独的实验研究，从而增加实验的复杂性。1982年，Davies等引进微载体技术，将两种细胞分别种植于微载体上，然后将微载体混合于同一体系，实验中相临的微载体上同型或异性细胞间都形成接触连接。这种方法很好地将两种细胞分离，使其独立存在，从而为单独研究联合培养体系中某一种细胞提供了方便，但不能反映生理状态下细胞的生长结构层次关系。2000年，DiLuozzo等以双层（bilayer）作为联合培养的载体，研究发现，平滑肌细胞能够促进EC生成NO，抑制内皮素1（endothelin－1，ET1）RNA的转录和ET1蛋白的表达，而NOS抑制剂可取消平滑肌细胞对ET1的抑制。因此，平滑肌细胞可能通过调节内皮细胞NO的活性而间接抑制ET1的生成。另外，ET1与ET1B受体结合可促进EC刺激平滑肌细胞增生。2002年，Imberti等在联合培养模型的基础上，引起流动装置，模仿体内血流动力学环境，进一步观察了剪切力对联合培养的EC和平滑肌细胞的影响。2003年，Vouyouka等利用EC－SMC联合培养体外模型，观察了高血压状态下，EC对平滑肌细胞增殖和收缩表型的影响，为更好地认识高血压疾病中细胞间的相互作用提供了理论依据。相信基因治疗和组织工程学的应用，以及两种方法的合理结合，为找寻血管疾病的病因和预防，治疗心血管疾病开辟了乐观的前景。

三、分子病理学的研究

分子病理学是以分子生物学的理论、技术和方法来研究心血管的结构，功能和调节的变化，研究心血管病的发病机制，寻求新的诊断和治疗的方法。

虽然细胞病理学和超微病理学的发展为疾病的诊断提供了重要的依据，免疫组化技术的创建和应用对诊断病理学的发展起进一步的推动作用，但所论及的基本上是细胞和组织的病变，属于表现型的范畴。随着近年来分子病理学的形成和不断充实，使得我们能从基因型和分子模式水平认识疾病，论述疾病发生发展规律。

动脉粥样硬化是心脑血管病的重要病理基础，随着分子生物学理论和技术的发展，人们逐渐认识到，动脉粥样硬化形成过程涉及的多种蛋白和基因，其中主要包括脂蛋白受体、黏附分子、生长因子、细胞因子、基质金属蛋白酶和吞噬作用相关基因。近几年来，动脉粥样硬化的分子病理学研究正在逐步深入。

1．血管活性物质内皮素／氧化亚氮（ET／NO）在动脉粥样硬化斑块中的表达和作用　已知内皮细胞可以产生多种生物活性物质，其中内皮衍化收缩因子（EDCF／ET）和舒张因子（EDRF／NO）是一对最重要的调节因子，ET由日本学者Yanagisawa等于1988年从培养的猪主动脉内皮细胞首次分离纯化，具有极强的缩血管和促进VSMC增殖的作用，而NO由Furchgott和Zawadski在1980年首次观察到，他们发现乙酰胆碱可引起血管内皮释放一种血管舒张因子（即后来证实的NO）。1991年，Bredt等将脑组织中的NO克隆出来。NO具有舒张血管及抑制血管平滑肌细胞增殖的作用，二者调节着血管舒缩和血管平滑肌细胞增殖。1994年，Michacls等在中国仓鼠卵巢细胞和人类脐静脉内皮细胞上观察到NO可终止ET－1的生理信号转导。人及家兔的动脉粥样硬化斑块及大鼠气囊剥脱内皮后形成的再狭窄模型，经免疫组化染色证明动脉粥样硬化斑块内和再狭窄病变部分的增生SMC内均含有大量ET，而NO减少，又经原位杂交证明这些增生的平滑肌细胞内有ET和ET1型受体（ET1－R）mRNA转录，而正常及斑块旁动脉内膜很少见。同时发现NO mRNA仅见于正常动脉，表明增生的SMC ET合成增加，NO减少。ET在促进SMC增生中起了重要作用，增生的SMC通过自分泌和旁分泌进一步促进自身的增生。

2．动脉粥样硬化斑块中的癌基因及抗癌基因的表达　凡能编码生长因子、生长因子受体、细胞内信息分子转录调节因子的基因，即凡能编码关键性调控蛋白的正常细胞基因，均可称为原癌基因。一定条件下，原癌基因被激活成癌基因，导致细胞、组织异常增殖。1976年，Bishop等正式发现癌基因，抗癌基因也只是在1986年才被分离和鉴定，在短短20多年里，对癌基因的研究取得了重大的成绩。

动脉粥样硬化是一种以细胞增生为主的疾病，血管内皮细胞损伤，单核－巨噬细胞增生，浸润及SMC增生是其发生、发展的关键。在癌基因家族中，与动脉粥样硬化关系最为密切的是编码生长因子家族的sis基因和编码核蛋白家族中的myc及fos基因。c－fos，c－myc的表达产物是一类DNA结合蛋白质，位于核内，这些DNA结合蛋白质可以促进那些与细胞增殖有关基因的开放，从而产生细胞增殖效应，c－fos，c－myc基因表达可使静止状态的细胞（G0期细胞）进入G1期，然后很快进入S期，加入到细胞周期中运行。同时，cfos，c－myc还作为获能基因，启动很多与生长有关基因的表达。有人发现胎鼠和新生大鼠的VSMC myc和fos表达高，而成年大鼠VSMC myc和fos表达少。在培养的成年鼠VSMC中加入新鲜胎牛血清后，myc和fos基因表达迅速升高，达高峰后细胞迅速增生，提示c－fos，c－myc基因的表达是触发SMC增殖的关键因素和始动因素。

1985年，Collins等发现内皮细胞能产生和分泌PDGF，它是sis基因的表达产物。正常情况下，sis基因极少表达；内皮受损后，sis基因大量表达，产生和分泌PDGF，促进VSMC和成纤维细胞迅速增生并向内膜下迁移，与沉积的脂质共同构成了粥样斑块。

抗癌基因的突变也是动脉粥样硬化的SMC增殖异常的原因。p53抗癌基因（p53　anti－oncogene）是目前唯一研究比较明确，定位于细胞核内和抑制细胞增殖的抗癌基因。

3．心血管病实验性基因治疗的研究　分子生物学理论和技术的进步，使人们认识到许多心血管疾病是由于一些基因结构和表达异常引起的。基因治疗是应用基因工程和细胞生物学技术，将功能正常的基因转移到病变细胞或体细胞中，修复或补充失去正常功能的基因及其表达产生，或抑制体内某些基因的过度表达，从而达到治疗的目的。

目前基因治疗有间接基因导入法和直接基因导入法。间接基因导入法是先将目的基因导入中介细胞，通过选择性培养、扩增再输入体内，其中外源性基因的表达产物可通过循环分泌或旁分泌途径而发挥治疗作用。在心血管系统中常用的中介细胞有血管内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等。直接基因导入法即将重组的外源性基因，通过脂质体、病毒载体或直接注射至血管、肌肉或心肌组织，表达出所需蛋白质。心血管疾病的基因治疗虽处于实验阶段，但在血栓形成和再狭窄，高脂血症，高血压，动脉粥样硬化的防治中却具有广泛的应用前景。

1996年，Dzau等通过HVJ－脂质体将增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞分裂周期激酶的反义寡核苷酸（ODN）转染人气囊损伤的在体大鼠颈动脉，2周后新生内膜形成被完全抑制；一次转染后的抑制率持续达8周。在大鼠颈动脉血管成形术后应用cmyc或cmyb反义核苷酸也获得了显著的效果。

1996年，Murry等将带有肌源性基因MyoD的腺病毒载体注入心肌损伤后开始修复的肉芽组织，发现MyoD还能诱导其他肌特异性基因（肌浆蛋白和胚胎骨骼肌MHC）同时表达，提示利用此法有可能为心肌梗死区提供新的收缩性组织而不是瘢痕组织。同年，Schneider等则提出向心肌细胞提供重新进入细胞周期所必需的遗传信息，使之增殖而修复梗死区。1996年，Niranjan等观察到将带有ET－1基因的腺病毒载体注入大鼠，可使其血浆ET含量增高6倍，伴血压明显升高；阻断内皮素受体又可使血压恢复正常。1996年，Schiffrin等也发现某些高血压患者动脉中ET－1基因表达增强，表明ET受体拮抗剂可能对此类患者有效。1996年，体外法低密度脂蛋白受体基因转移治疗家族性高胆固醇血症已在临床获得初步成功，并证实为安全可靠。

基因治疗为心血管疾病治疗展示了广阔的前景。随着人类基因组计划（Human Genome Project）的实施和转基因方法的改进与完善。基因治疗定会成为治疗心血管疾病的有力途径。

形态学的研究仍然是病理学的根本，但当前尸检数量日益减少，新技术的应用不够普及。因此，要大力开展尸检、活检人体材料，把常规病理技术与免疫组化、电镜、免疫电镜、分子原位杂交、原位PCR、FISH等技术结合起来，发挥其各自的优势，力求人基因诊断、实验性基因治疗等方面有所突破。

随着分子生物学技术的应用，病理学的研究范围日趋广阔深入，今后的研究将致力于将临床病理和实验研究紧密结合，将经典形态学研究与分子生物学技术紧密结合，使心血管病理取得更大的成绩。

参考文献

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3　王家宁，胡大一，陈文彦，等．反义c－mycRNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用．临床心血管病杂志，1998，4：235－239