乙型肝炎病毒基因组的结构与功能

乙型肝炎病毒是目前已知的感染人类最小的双链DNA病毒。基因组结构精密，功能齐全，以最小的容量发挥高效功能。其独特的基因结构为小环状、部分双股HBV-DNA，即乙型肝炎病毒基因组。HBV-DNA较长的一链为负链，全长约3.2kb个核苷酸，较短的一链为正链，双链长度不对称，正链不完全封闭，仅5′端固定。其长度可为负链50%～100%。因而在HBV群体中有不同长度的正链与全长负链相匹配，仅有部分长度为双链（图2-1）。两链的5′端间固定，5′端间的224bp为黏性末端，其两侧各有顺向，11bp的直接重复序列（DR）。DR1和DR2在病毒复制中起重要作用。DR1是前基因组RNA和负链DNA合成的起点；DR1和DR2的相对同源性，使HBV-DNA分子在复制过程中形成长粘性末端，进而形成环状（图2-2）。

HBV负链核苷序列的4个ORF为：S基因区、C基因区、P基因区和X基因区，分别编码外膜蛋白（HBsAg）、DNA聚合酶、核壳蛋白HBeAg／HBcAg和HBxAg。各ORF的组成及功能分述如下。

（一）S基因区（S-ORF）

S-ORF全长1　167bp。由S基因，前S1基因及前S2基因（近期发现的前－前-S）组成。

SHBsAg：S基因（678bp）编码含226个氨基酸多肽，称为S蛋白，小表面抗原（SHBsAg）或主蛋白。可能由cccDNA在RNA聚合酶作用下由2.1kb s-mRNA合成。

图2-1　乙型肝炎病毒基因组结构示意图
负链的4个ORF为：S基因区（前S1、前S2、S）；C基因区（前C和C）；P基因区；X基因区
（引自：韩硬海.临床肝脏病学.济南：山东科学技术出版社，2004.）

图2-2　乙型肝炎病毒的结构示意图
DNA-Plus-Strang.DNA正链；DNA-Minus-Strang.DNA负链；GenC.C基因；RegionX.X基因区；RegionP.P基因区；GenS.S基因；Pr-S1.前S1；Pr-S2.前S2；PrC.前C区；Terminales Protein.末端蛋白；DNA Polymerase.DNA聚合酶；RNAse.RNA酶；Core.核；Hülle.外壳
（引自：郝连杰，译.肝炎及其后果.5版.北京：人民卫生出版社，2001.）

MHBsAg：前S2基因（165bp）编码含55个氨基酸多肽，称前S2蛋白；前S2基因和S基因连续编码的多肽（含前S2蛋白和S蛋白）称为中表面抗原（MHBsAg）或中蛋白。亦为cccDNA在RNA聚合酶作用下由2.1kb，mRNA合成。

LHBsAg：前S1基因（324bp）编码含108个氨基酸的多肽，称为前S1蛋白。为cccDNA在RNA聚合酶作用下，由2.4kbmRNA合成（图2-3）。

图2-3　乙型肝炎病毒复制周期
（引自：李梦东.实用传染病学.3版.北京：人民卫生出版社，2004.）

前S1基因，前S2基因和S基因连续编码的多肽（含前S1蛋白、前S2蛋白和S蛋白）称大表面抗原（LHBsAg）或大蛋白。主蛋白、中蛋白及大蛋白分别以SHBsAg、MHBsAg、LHBsAg取而代之。S-ORF上述各段编码产物均属于HBV包膜蛋白（HBsAg）的范畴。HBsAg中的前S1蛋白和前S2蛋白与HBV侵入肝细胞有关。血清中的前S1蛋白和前S2蛋白出现较早，是传染性的标志。MHBsAg含前S2蛋白，LHBsAg含前S1蛋白和前S2蛋白，其血清内阳性也提示有传染性。

HBsAg在HBV复制时可出现在受感染的肝细胞质，肝细胞膜和血循环中。AHB时，于潜伏期后，HBsAg可在血中被检出，至4～5个月转阴。如果HBsAg在体内持续存在6个月仍不消失，则可伴随CHB或AsC或AsL长期存在体内。

HBsAg在CHB或AsC过程中于HBV复制时，除由2.1kb RNA和2.4kb RNA合成外还可由HBV-DNA片段整合入肝细胞DNA中的肝细胞不断产生。即使HBV停止复制，或HBV从体内被彻底清除，血液中HBsAg仍可阳性。此种情况从理论上分析，似应无传染性。在临床实践中对于HBV-DNA、HBeAg均阴性，ALT正常的非活动性慢性HBsAg携带者（AsL），只进行医学观察，不进行特殊治疗。

HBsAg在AHB患者血清内转阴时，其特异性抗体HBsAb转阳之间相隔数周时间，血清中即测不出HBsAg，也测不出HBsAb，称为“窗口期”。此期HBsAg和HBsAb以免疫复合物形式存在于血循环中。HBsAb是保护性抗体，是有免疫力的标志。血清前S1和前S2的特异抗体，抗－前S1和抗－前S2出现时间比HBsAb早，也是HBV复制减弱或将被清除的标志。非HBV感染者注射乙肝疫苗（HBVac）后产生HBsAb也是对HBV有免疫力的标志。

1.HBsAg的亚型　HBsAg有4个主要血清型：adr、adw、ayr、ayw。又因r和w还可细分，故有10个亚型：adr、adw2、adw4、adyw、adyr、ayw1、ayw3、ayw4、ayw2、ayr。共同决定簇a的抗体对不同亚型感染有保护作用，但交叉免疫不完全。亚型决定簇只诱导本亚型的保护性免疫。

我国长江以北以adr占优势，长江以南以adr和adw混存，新疆、西藏、内蒙古当地民族几乎均为ayw2、ayw3和ayw4。

2.HBsAg与HBsAb共存　在HBV感染的恢复期3%可以同时检测到HBsAg和HB－sAb。这种现象提示病人有活跃的免疫反应，肝脏也有较明显的炎性变化，其原因为：①抗原抗体转换阶段；②不同亚型的重叠感染；③不同亚型间的转换；④HBV2感染；⑤S基因变异；⑥免疫逃避。

HBV2感染是由HBV变异株引起，其特点是单项HBsAg（＋），恢复期无HBsAb血清转换，或血清中同时检出HBsAg和HBsAb。前者被认为HBV2感染HBV易感者引起，后者是HBV感染已产生HBsAb的HBV非易感者（免疫接种或自然免疫）引起。

HBsAg“a”决定簇是具有高度免疫原性和序列保守的HBV各亚型的共同决定簇，其在124、137、139、147位各有一个半胱氨酸残基，借其巯基间二硫键形成一个双环结构来维持HBsAg的抗原性。实验表明HBsAg145位氨基酸被替换可显著降低HBsAg的抗原性，使之不能与a单克隆抗体及疫苗接种抗体或恢复期血清抗体结合或结合力下降，导致HBV清除力下降，形成免疫逃避株感染。Jongerious JM等也报道“a”决定簇或其邻近位点的变异导致HBsAg与HBsAb共存。

3.HBsAg（－）／HBV-DNA（＋）　李欣华等报道，乙型肝炎标志物全为阴性的人群中，仍有4.3%的HBV-DNA（＋），虽其含量呈低水平，但仍不容勿视。侯金林等报道，中国是HBV感染高发地区，用PCR技术，已发现30%～40%HBsAg（－），所谓隐原性肝硬化、非甲非乙型慢性肝炎患者仍为慢性HBV感染，在我国台湾和广东地区1%～3%单项HBcAb（＋）献血员有低水平HBV感染。他们对2例HBsAg（－）／HBV-DNA（＋）感染者HBV-DNA S基因进行全序列分析，并与同时获得的HBsAg（＋）病例序列和已发表的序列进行比较发现一种新的HBV变异株。由于此变异株的发现，使人们注意到HBsAg（－）感染者血清学可表现为HBV标志物全无或仅HBcAb（＋），临床上可为完全健康的献血员或肝炎患者，常规酶免法或放免法不能检出HBsAg，仅PCR和（或）斑点杂交HBV-DAN（＋）。孙秀凤报道，HBsAg（－）／HBV-DAN（＋），其原因为以下几点：①病毒S基因突变，因变异的HBsAg与单克隆抗体的亲和力下降，从而导致现有试剂难以检出；②HBsAg低水平表达，用常规的ELIS方法难以检出；③X区基因突变，从而抑制了X－pro的转录活性及对病毒增强子和启动子的作用，影响了HBsAg的表达；④重叠感染，因HCV重叠感染干扰了HBsAg的合成。

4.HBsAb（＋）／HBV-DNA（＋）　李欣华等报道，在275份HBsAb（＋）血清标本中有12例HBV-DNA（＋）（4.4%）。吕娇健等报道，临床上少数HBsAb（＋），肝功能反复异常者，经血清HBV-DAN和肝穿活检免疫组化检测证实，其中39.7%患者系HBV感染。孙秀凤报道，在单项HBsAb（＋）者中HBV-DAN检出率为11.8%，其可能原因为：①HBV的S基因突变，HBsAg突变株的再度感染；②HBV的X基因突变，抑制了X蛋白的免疫活性及病毒增强子和启动子的作用，影响了HBsAg的表达；③在血清HBsAb转换后，肝细胞内仍可存在HBV-DNA的持续低水平复制。HBsAg呈低水平表达，用常规方法难以检出；④因为HBsAb主要清除细胞外的病毒颗粒，而细胞内的病毒颗粒则需要特异性细胞免疫来完成，部分患者的细胞免疫始终处于低水平。黄利华等报道，在“套式PCR检测HBsAb（＋）者血清HBV-DNA及序列分析”试验中检测结果表明，64例血清标本用常规PCR法检测HBV-DNA阳性率为：29.7%（19／64），套式PCR法检测阳性率为：84.4%（54／64），X2＝39.1，P＜0.01，有显著性差异。本研究发现HBsAb与HBV-DNA同时存在时，HBsAb未能起到中和HBV的作用。Van Nunen报道，慢性肝炎患者HBsAb对HBsAg的中和作用不如预想的那么有效。因此，联合使用抗病毒药物、接受了HBVac注射后产生的HBsAb有时能误导我们认为产生了免疫力，而实际上仍存在HBV慢性感染。

在HBsAb与HBV-DNA共存者中存在基因变异，导致HBsAb几尽丧失对HBsAg的中和作用。对套式PCR阳性／常规PCR阴性血清HBV-DNA基因测序结果同样发现：HBsAg“a”决定簇及其两外侧端的氨基酸存在变异，导致HBsAb不能中和病毒而与HBV-DNA共存，病毒低水平复制。

李琼等在《HBsAb阳性患者血清HBV-DNA定量检测》一文提出如下参考意见：①不能机械地看待某一项检测指标，多数情况下，HBsAb是乙型肝炎痊愈，并产生永久性保护力的良好指标，或者是HBVac注射后有效的表现。少数情况下，HBsAb仍可伴有HBV的存在和复制。因此还要进行其他乙型肝炎指标的检验，像HBV-DNA、肝组织活检等。②慢性HBV感染者，即使在HBsAg清除之后，发生不良并发症（主要是HCC和肝硬化）的情况并不罕见。所以，不管血清HBsAb状态如何，不要立即评价为HBV已清除而放弃继续监测和治疗。③由于HBsAb（＋），HBV-DNA定量阳性，具有一定的隐蔽性，给供血员筛选及HBV传染源的管理带来了更大的困难，因而期望研制出灵敏度高的试剂，以阻断传播途径。

5.HBsAg低值弱阳性　姜玉章等，对“HBsAg低值弱阳性的临床价值”进行了研究分析，指出HBV血清标志物HBsAg在ELIS法的检测中，由于不同试剂盒的敏感度各异，（一般试剂盒检测灵敏度为1.0ng／ml，而有些佳质试剂盒可达到0.1～0.5ng／ml）常出现少数易被忽视的HBsAg含量在0.5～2.0ng／ml的低值弱阳性，被误报为阴性的现象。对80例HBsAg低值弱阳性HB的标本进行分析后认为，产生HBsAg低值弱阳性的现象很可能是HB患者的免疫功能受损后，机体对HBV或其应答产物产生新的免疫平衡的反应。一般情况下，不具严重的致病性，但在重新受到HBV的严重感染下可能被激活，而导致病情加重，甚至癌变。

6.HBsAg基因在烟草的表达　李缨等报道，以植物医学基因工程理论为指导，建立在植物中表达HBsAg的体系及方法，为研究植物乙型肝炎疫苗打下基础。用植物生产疫苗具有成本低、接种简便、安全可靠等许多优点。这一项植物疫苗基础研究，是一项探索性研究。初步结果表明，转基因植物（将重组基因转染烟草）能表达具有免疫原性的HBsAg。下一步是通过动物实验来证明植物表达的HBsAg的免疫原性。

7.HBsAg的临床意义　HBsAg是HBV感染的重要标志，也是最早出现的标志。HBsAg由酯类多肽组成，不具有传染性，具有免疫性，可刺激机体产生有保护作用的相应抗体（HBsAb）。由于完整的病毒颗粒具有HBsAg组成的外壳，故HBsAg是HBV感染的指标之一。

（二）C基因区（C-ORF）

C-ORF：全长636bp，由前C基因和C基因组成。前C基因87bp，编码29个氨基酸多肽，称为功能信号肽。C基因549bp，编码138个氨基酸多肽，称为核心蛋白（即HBcAg）。功能信号肽具有生成和分泌HBe蛋白的重要作用。如果从前C基因起始密码子启动前C基因和C基因连续编码，则产生前核心／核心前体蛋白，或称乙型肝炎e抗原（HBeAg）前体蛋白。功能信号肽将HBeAg前体蛋白引导至细胞内质网，其氨基酸端和羧基端被部分削减，即形成HBeAg。

HBcAg：HBV复制时HBcAg表达于肝细胞内，分胞核型、胞质型、胞膜型。血清中检测不出HBcAg。其特异性抗体为HBcAb。血清中HBcAb动态变化（图2-4和图2-5）。高滴度HBcIgM阳性间接表示HBV复制，是传染性标志，HBcIgG阳性表示既往感染。HBcAg有高免疫原性，一些HBV感染者缺乏HBcAb，一般不是由于病毒HBc序列的变异，而是宿主免疫系统的异常。HBcAg的免疫应答在病毒清除中可能有重要作用。低水平HBV感染时，血清中可出现单独HBcAb阳性。刘伟等报道，在HB引起的肝炎肝硬化患者肝组织中，HBV有较高的复制率；静脉血中HBV呈高复制状态下，肝组织中HBcAg和HBV-DNA的阳性表达，有较好的一致性，利用静脉血中HBV检测结果来判断肝组织中HBV复制状态，有一定价值；但在静脉血中HBV呈低复制状态时，两者的一致性较差，依此判断肝组织HBV复制状态，还欠精确性。

图2-4　急性乙型病毒性肝炎血清抗原抗体动态变化

图2-5　慢性乙型病毒性肝炎血清抗原抗体动态变化

Klaus-peter Maier在“肝炎及其后果”中指出，HBcAg是病毒核蛋白的组成部分，因被壳所包裹，在外周血中不易检出，在肝细胞核内用免疫荧光法可以证实。人们认为通过偶然释放游离HBcAg的诱导形成抗体（HBcAb）。

HBcAb：所有的HBV感染者均形成针对HBcAg的抗体，HBcAb可终身检出。此标志是近期或正在发生炎症非常敏感的指标，有时是HB患者（亚临床经过）惟一的指标，此类病人一般血清HBV-DNA（＋）。但必须指出，这类仅有HBcAb阳性的患者，实际上确实有HBV活跃复制者不足10%，而多为感染过HBV者，其HBsAb已转为阴性。这类既往感染者，如果进行预防接种，在一次免疫后HBsAb迅速出现。此外，虽然单一HBcAb（＋）提示HBV复制频率可能相对较低，但发现患者转氨酶升高时，还必须考虑是否存在继发感染。

HBcIgM在AHB或CHB急性发作时显阳性，一般感染后持续阳性6个月以上。此标志也可在AsC中检出，仅有滴度高低之差。HBcIgG出现较迟，但可保持多年。在疾病的窗口期，即HBsAg已被清除，HBsAb出现之前，可通过检测HBcAb发现病人。

1.HBcAb的临床意义　HBcAb是HBV感染血清中出现早、滴度高、持续时间长的抗体。几乎所有HBV感染者都可产生HBcAb。高滴度的HBcAb表示现行感染，常与HBsAg并存。低滴度的HBcAb表示既往感染，常与HBsAb并存。

（1）HBcIgM（＋）：是HBV感染早期出现的抗体，是反映肝内近期HBcAg复制指标。表示为：①AHB；②高滴度、长期（＞6个月）预示慢性化；③慢性HBV感染者中，与病情活动及损害轻重有关；④在AsC中通常为阴性。

（2）HBcIgG不是保护性抗体，而是反映HBV感染的重要指标。测定HBcAb能检出靠检测HBsAg不能发现的HBV感染者。

2.单一HBcAb（＋）　有5%～10%HBV感染者表现为单一HBcAb（＋）。单一HBcAb（＋）的血液可以引起HBV的输血后肝炎。所以应当注意单一HBcAb（＋）现象。如同时检查HBV-DNA、ALT可能预防输血肝炎的发生。

单一HBcAb（＋）的可能原因有：①见于HBsAg、HBeAb及HBcAb同时阳性的HBV感染者，以后由于某种原因HBsAg及HBeAb低于可检出水平。此时病人的HBcAb滴度通常较高，可检出HBV-DNA；②远期感染伴低水平的HBsAg，属于现症感染的一种特殊形式；③远期感染伴HBsAb消失，属于恢复期的一种表现形式；④HBcAb被动转移，如输入含HB－cAb的血液和血制品；⑤假阳性，特别是弱阳性者。这种情况多见于IgM类成分的干扰。

3.HBeAg HBeAg不属于HBV的结构蛋白，是核壳蛋白的分泌型，是HBcAg的降解产物。HBV复制时HBeAg在肝细胞的分布有胞质型和胞膜型。血清HBeAg及其特异性抗体的动态变化。

HBeAg与HBV-DNA和DNAP密切相关，其阳性表示HBV复制活跃，是传染性强的标志。在AHB时HBeAg仅数天或数周内在血清中检出，病人在首次就医时往往HBeAg已转阴。在HBV感染者血清中HBeAg有两类分子形态，即游离的小分子HBeAg和大分子HBeAg。与IgG结合的大分子HBeAg可以透过胎盘。血清含大分子HBeAg的HBsAg（＋）母亲的胎儿，在出生前可能已感染HBV。在HBV感染的自然病程中，血清内HBeAg由小分子为主逐渐过渡到大分子为主，最后转化为HBeAb。但这一过程是缓慢的，从几个月到10年以上不等。

（1）HBeAg（＋）的临床意义：①AHB；②是有传染性指标，反映HB病人、AsC及HBV感染孕妇的传染性的强弱；③是感染性指标，反应HBV正在复制；④与HBeAb同时存在，可能是HBe血清转换。

HBsAg（－），HBeAg（＋）的可能原因为：①检测HBsAg的方法不灵敏，或HBsAg与HBsAb形成免疫复合物；②HBV S区基因变异；③HBeAg假阳性。

（2）HBeAb（＋）的临床意义：①HBV复制减弱，病变趋于静止，传染性降低。血清HBe转换是感染过程中的一个转折点；②HBeAb（＋），而HBV-DNA也阳性时，提示前C区基因变异。因前C区基因变异，导致该区产生一个新的终止密码子，HBeAg不能产生而表现为阴性或HBeAb（＋），但HBV仍在活动性复制，甚至病情加重。临床多见于CHB及急性重型肝炎。接受IFN治疗的病人也可发生上述突变。

在AHB时，HBeAb在HBeAg转阴后，与HBsAb同时出现，表示HBV复制减少，一般持续1～2年。HBeAb长期存在时，提示HBV-DNA已和宿主DNA整合。

（三）P基因区（P-ORF）

P基因区在HBV-DNA序列中P基因是最长的ORF，全长2　496bp约占全基因组的75%。与其他基因组相互重叠。其开始区段与C基因的后部重叠；其中间区段与前S区S区重叠；其末端则与X基因的后侧大部分序列重叠。编码含832个氨基酸多肽，称为HBVDAN聚合酶（DNAP，或P蛋白）。DNAP是HBV-DNA合成所必需的，参与HBV复制的全过程。DNAP是一种具有多功能的酶分子，具有DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）、RNA指导的DNA聚合酶（RDDP）和RNA酶H活性。血清DNAP阳性是HBV复制和有传染性的标志。不论是急性还是慢性HB，DNAP与HBeAg、HBV-DNA之间均存在明显相关性。DNAP在HBV复制过程中有如下功能：

1.前基因组RNA的包装　P蛋白选择病毒前基因组RNA，裹入亚核颗粒，作为反转录的模板。可能P蛋白直接结合于RNA，或与HBcAg相互作用，形成一复合物可以识别RNA，使其掺入亚病毒核心。

2.引导DNA合成　联结负链DNA　5′端的末端蛋白，引导DNA负链的合成，末端蛋白是由前基因组RNA进行反转录的引物。

3.反转录酶／DNA聚合酶活性　由前基因组RNA反转录负链DNA，负链DNA合成和延长正链DNA都由DNAP的酶活性完成。

4.RNA-DNA杂交体中RNA的清除　以前基因组RNA为模板，反转录成DNA，形成RNA-DNA杂交体。随着DNA延长，由RNA酶H活性清除杂交体中的RNA，留下单链DNA。

（四）X基因区（X-ORF）

X基因区是HBV基因的最小编码区。全长462bp，编码154个氨基酸多肽，称为乙型肝炎X抗原（HBxAg）。HBV复制时HBxAg在肝细胞的分布与HBcAg相似。血清HBxAg也是HBV复制和传染性的标志。血清HBxAg及其特异抗体HBxAb动态变化与HBeAg及HBeAb大体一致。HBxAg有反式激活功能，即某一基因的编码蛋白转而激活同一基因的远离部位，或另一基因的转录和表达。

HBxAg不仅能反式激活C基因启动子，从而也启动前基因组和mRNA的转录，增强HBV的复制和表达，还可作为一种反式激活因子，激活肝细胞基因组内的原癌基因（oncogene）及细胞生长（受体）的表达，它同时能与生长负性调节因子p53结合形成复合物使p53失活，而p53基因对于基因组的稳定性、细胞周期、诱导凋亡密切相关，并通过对细胞的信号干扰改变细胞的生长特性，使正常细胞DNA修复受损，上述均能促使肝细胞癌变，故与原发性肝癌的发生有关。

血清HBxAb（＋）提示HBV复制减弱，但HBxAg（＋）的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌患者血清中常检出HBxAb。

HBV-DNA负链全长3　281bp，而4个主要ORF相加总长为4　374bp，所以各ORF必须重叠，以反复利用长度有限的基因组。