为了保证迅速、及时、合适的分切组织,技术员必须到肾活检现场,并做好充分的准备工作。
【准备工作】
1.取一块纱布用生理盐水浸透,以拧不出水,而又潮湿为宜。纱布内放一块编好号的胶布(因胶布潮湿后不易写字),置入培养器皿内备用,每个肾穿刺患者,需分别准备一块这样的纱布。纱布不能太湿,否则肾组织浸在水中容易造成组织自溶;也不能太干,以免组织干涸,影响抗原性。两者均会影响染色效果。
2.用一个清洁的5ml标本瓶,加入光镜固定液3ml(FAA固定液:甲醛溶液10ml,冰醋酸5ml,95%乙醇85ml混匀),盖塞紧后备用(以防乙醇挥发)。
3.用一个清洁的5ml标本瓶,加入冷电镜固定液3ml[2.5%戊二醛10ml,双蒸馏水40ml,混匀后再加pH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)50ml,冰箱内保存],置冰箱内备用。
4.解剖显微镜一架,冰瓶一个,眼科手术平镊一把,直尺一把,双面刀片一把,蜡板一块。
5.上述光镜固定液小瓶、电镜固定液小瓶及培养皿均应在肾穿刺术数小时前准备完毕,并将其置于冰箱内备用。
【取材判断】
经皮肾活检术所获取的肾组织一般包括以下几种成分:皮质组织、皮髓交界组织以及皮质-髓质-皮质组织。穿刺取得肾组织后,立即用生理盐水冲洗数次以除血迹。
1.迅速判断所取组织是否为肾组织,还是其他类型的组织,如肌肉组织、结缔组织、脂肪组织等。
2.当确定为肾组织后,立即将组织置于蜡板上,迅速测量其长度(mm),并记录。
3.用解剖显微镜或放大镜进行观察,以区别皮质和髓质,并仔细观察标本是否有肾小球。在解剖显微镜下,肾皮质色较淡,皮质区可见一些分布不规则,朦胧的红色小点,此即肾小球。使用解剖显微镜可大大帮助区别组织,作出正确的判断。但随着经验的积累,也可用肉眼判定。
4.要使肾活检诊断的可靠,所取标本的量是至关重要的。如无肾小球或皮质部分少于1ml,要考虑再次穿刺,取得的组织要迅速分切后固定。
【标本分切】
用国产18号Menghini型穿刺针(针长15cm,内径1.4mm)取得的肾组织粗细适中,一次取得组织以1.5~2.0cm为最佳。组织取出后用小镊子将组织轻轻地夹到蜡板上,镜下观察,量出长度,用锐利的刀片将组织间隔切成1mm、2mm及4mm长的数段,分别供电子显微镜、免疫荧光、免疫酶标、光学显微镜检查用。首先分取电镜标本,要求组织少而精,取皮质区1mm长度即可,要求肾小球至少1个;其次分配免疫病理检查所需组织,约2mm,要求肾小球至少3~5个;其余组织留作光镜检查用,要求肾小球至少10个。
【标本处理】
1.免疫荧光及免疫酶标 将分切后的组织迅速放入事先冷藏的培养皿内的湿纱布中,置入冰瓶立即送至恒温冷冻切片机内(<-30℃)进行包埋、切片。如果不能马上切片,标本必须立即保存于-40~-70℃低温冰箱内,以保持抗原活性,防止抗原移位或流失,但在低温冰箱内放置时间不宜超过2d。
2.光镜 将分切后的组织平放在蜡板上,勿使其扭曲,用小镊子蘸少许光镜固定液于组织表面,30s左右使组织稍稍硬直后,再将整条组织放入固定液内。这样固定的组织平整、不易弯曲,便于切出完整的切片。
3.电镜 将分切后的组织立即放入2.5%戊二醛固定液中,置于冰瓶内送至电镜室。
【注意事项】
1.观察和分切标本应在短时间内完成,并注意保持肾组织湿润,切勿使其干涸。
2.在解剖显微镜下观察组织时,光线不宜太强,否则组织容易干涸,肾小球也不易看清。
3.供免疫荧光检查用的肾组织应避免接触固定液,特别是含乙醇的固定液,以免影响冰冻切片检查结果。电镜固定液和光镜固定液不得互相混入。
4.组织未经固定前,镊子夹取组织的动作要轻,勿牵扯组织,避免人为因素造成组织细胞变形。
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