免疫组织化学在临床病理学中的应用

免疫组织化学技术是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显示剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，并借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜对相应抗原进行定位、定性、定量测定的技术。其在现代生物学领域中得到了广泛的应用，在基础医学和临床医学的研究中发挥了重要作用，在疾病诊治尤其是在肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究方面是一种有效的手段。其特点是特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合。

（一）免疫组化种类

1.免疫荧光组织化学技术是Coons和Coworkers在1941年建立的一种方法。其基本原理是先将已知的抗体或抗原标记上荧光素，再用这种标记物去检查细胞或组织标本上相应抗原或抗体，在形成的抗原抗体复合物上由于含有荧光素，在用荧光显微镜观察标本时，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，故在显微镜下可以清晰地观测到荧光所在的细胞或组织，从而鉴定其抗原或抗体的性质，也可以结合定量技术计算含量。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素和四甲基异氰酸罗达明等。

2.免疫酶组织化学技术是20世纪60年代发展起来的新方法。它把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用机制有效地结合起来，既具有免疫荧光的优点，又克服了它不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的缺点，是目前最常用的方法。此技术将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，借助酶与底物的特异性催化作用，生成不溶性颜色产物或具有一定电子密度的颗粒，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。与免疫荧光相比较，酶标记抗体试剂容易制备而且稳定，可长期保存，技术操作简单且敏感性也较高。

3.免疫金银染色技术免疫金银法是在免疫金法的基础之上发展形成的，两者均以胶体金作为标记物，是一种灵敏而经济的新型免疫组织化学染色方法，可进行细胞表面和细胞内多糖、糖蛋白、多肽、抗原及激素等生物大分子的精确定位。

4.免疫组织化学的双重和多重染色技术应用免疫组织化学的方法在同一张组织切片或细胞涂片上同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，并在同一张切片上可同时观察到两种或两种以上的抗原成分，即为双重或多重免疫染色。通过光镜下对标记物或其反应生成物的颜色进行观察来确定不同的抗原成分，帮助人们了解含有这类不同抗原的各种细胞、组织之间的相互关系。电镜下则可通过标记物颗粒的大小或反应物电子密度不同来显示不同的抗原成分，这样可以深入了解同一细胞内不同细胞之间及不同分子之间的相互关系，以及抗原物质在细胞内的合成、转运及代谢的途径，把形态和功能研究更好地结合起来。

（二）免疫组化显示法

根据标记抗体的种类、使用次序以及与抗原结合的方式、关系，可将免疫组化反应分为直接法、间接法、桥联法、可溶性酶抗酶复合体法（PAP）、卵白素生物素复合物（ABC）法等。

1.直接法把荧光素或酶标记在第一抗体上，然后用标记的一抗直接在细胞上显示相应的抗原。此法特异性强、需时短、简便，但每种抗原必须分别用其抗体的荧光素或酶标记物，且敏感性较间接法低。常用于检测IgG、IgA、C3和C4补体等。

2.间接法将荧光素、酶和胶体金等标记在能与第一抗体普遍结合的第二抗体上，待测一抗与抗原结合后，再用标记了的二抗与一抗反应，从而显示未知抗原。本法提高了灵敏度，一种标记二抗可与多种特异性一抗配合而显示多种抗原，但非特异性高。

3.桥联法当一抗（兔抗血清）与组织中抗原结合后，滴加一个过量的“桥”抗体（羊抗兔Ig），后者的一半Fab片断结合一抗，另一半Fab将结合标记的第三抗体和辣根过氧化物酶（HRP）结合，再显色。此法缺点较多，染色效果不理想。

4.酶-抗酶复合物法（PAP）采用预先结合好的可溶性酶（HRP）-抗酶抗体复合物，来取代桥联法的抗酶抗体和HRP两步反应。大大增加了敏感性。可用于常规石蜡切片，有利于回顾性研究和活检诊断。

5.ABC法（卵白素-生物素-酶复合物法）是目前较敏感的免疫组化方法。基本原理是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，现将卵白素和生物素偶联的过氧化物酶按一定的比例组合成卵白素－生物素－过氧化物酶复合物，由于一个卵白素分子具有可与生物素结合的4各位点，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶结合，另一部分可与生物素标记的免疫球蛋白反应。生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶分子相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白可以结合多个生物素分子，从而增强了免疫球蛋白或过氧化物酶结合卵白素的能力。这样卵白素就可作为桥梁，把生物素抗体结合物及生物素酶结合物连接起来，进而可偶合更多的酶分子，并且这种相互作用的连接能形成一种较大的类似晶体的复合物，从而大大提高了酶染色的灵敏度，而且非特异着色少，背景清晰，对比度极佳，有广阔应用前景。

6.S-P法（链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）用链霉素抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素蛋白即形成S-P法。染色原理同ABC法。国外公司也将此注册为LSAB法、LAB-SA法和SABC法。因S-P法最早建立和报道，其标记技术不断提高，以其染色时间较同类方法短和价格较低而在我国逐渐普及。

（三）免疫组化的应用

1.提高病理诊断准确性众所周知，正确及时地诊断是防治疾病的重要前提。国外对病理诊断报告的质量控制标准是石蜡切片要100%正确，术中快速诊断要98%正确。但在实际工作中要做到100%是不可能的，一是由于技术水平问题而误诊，二是由于目前鉴别诊断的手段不够而做不出诊断，在免疫组化应用以前，约有10%的肿瘤诊断属疑难病例。对这些病例采用免疫组化检查后，依据抗体的种类、数量及经验的不同，最后获得正确诊断的达50%～80%不等，即有一半以上的疑难病例，通过免疫组化检查，获得了正确诊断。比如来源不明的淋巴结转移性肿瘤，角蛋白抗体阳性，支持癌的诊断，S-100蛋白抗体阳性，则支持黑色素瘤的诊断，借助免疫组织化学检查为临床处理提供了可靠的依据。由此可见，应在所有的病理科普遍应用免疫组化方法，以利于肿瘤的临床诊治。

2.激素受体及生长因子检测对预后及治疗的意义激素受体和各种生长因子对正常组织的功能调节是必不可少的，同时也可影响着肿瘤的生物学行为。应用免疫组化方法，可对肿瘤内各种激素受体与生长因子进行定位、定量分析，并已广泛应用于肿瘤临床工作。如对乳腺癌与激素受体关系的研究已有了较明确的结论，即雌激素受体阳性的乳腺癌预后优于阴性者，而且阳性者对内分泌治疗反应好、无瘤生存期延长。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。目前已有针对癌细胞核内激素受体的免疫组化方法，检测核内的激素受体可作为乳腺癌对激素反应性的更重要的预测指标。

同时，表皮生长因子受体（EGFR）也是肿瘤预后判断的指标之一，表达EGFR者，无瘤生存期延长。

3.肿瘤发生相关基因蛋白的临床检测大量研究表明肿瘤发生的分子基础极其复杂，包括原癌基因激活、肿瘤抑制基因突变或缺失，细胞凋亡调节基因及DNA修复基因功能紊乱等。肿瘤基因在肿瘤生物学中的价值已被大量的研究证实。原癌基因主要的激活方式有基因的扩增、突变、染色体转位等，其活性的异常则通过mRNA和编码蛋白的水平增加表现出来，用免疫组化的方法可对这些蛋白进行定位和定量的检测。具有临床意义的癌基因主要是cerbB-2、c-myc、ras等。肿瘤抑制基因的两个等位基因都发生突变或丢失时，可导致细胞发生恶性转化，如p53基因。

在乳腺癌的研究中发现表达c-erbB-2的侵袭性乳腺癌者预后差。恶性度高者阳性率高。导管内癌中粉刺癌为阳性，筛状癌则为阴性。在卵巢癌中阳性率为30%，而且提示，阳性表达的卵巢癌者预后要差。

c-myc是作用于核内DNA的癌基因，可刺激DNA的合成。c-myc的过度表达则促进瘤的生长和发展，因而肿瘤的侵袭性增加。在对宫颈癌、小细胞肺癌的研究中已证实，表面cmyc增加者存活期缩短。

p21是一种ras瘤蛋白，已发现在肝细胞癌、大肠癌中表达增高，在卵巢癌亦有过度表达的报道。对于其预后意义则仍有一些不同看法。

在肿瘤抑制基因中了解较多的有p53基因、RB基因和APC基因等。p53蛋白结合在DNA的特定片段上，对细胞通过G1期起到阻断作用，分为突变型与野生型两种。突变型p53蛋白半衰期长，在癌细胞内可较多积聚，故易于用免疫组化方法测出。目前发现p53基因突变是人体癌症中最常见的，可见于70%的大肠癌，30%～50%的乳腺癌、50%的肺癌，其中小细胞癌达100%。

4.对肿瘤细胞增生程度的评价肿瘤细胞增生是否活跃直接影响着临床治疗与预后。传统上判断一个肿瘤是否生长活跃靠病理组织学观察细胞分裂象的多少来判定，但由于计数不准确以及影响因素太多导致临床应用价值有限。其他方法还有核仁组成区嗜银蛋白（Ag－NOR）的染色、3　H-胸腺嘧啶摄入放射自显影、流式细胞术（FCM）等。但实践证明其中以免疫组化方法对瘤细胞增生抗原进行定位、定量最为简便可靠，其主要是通过Ki-67和PCNA（proliferationg cell nuclear antigen）的单克隆抗体来实现的。已证明这些肿瘤增生抗原与许多肿瘤的预后有关，即Ki-67或PCNA阳性细胞多者，其恶性度增高，预后不良，以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。

5.发现微小转移灶用常规病理组织学方法要在组织中辨认出单个或几个转移性肿瘤细胞是非常困难的，而采用免疫组化方法则十分有助于微小转移灶的发现。如对一组常规病理切片认为阴性的乳腺癌淋巴结，经免疫组化检查后，证实其淋巴结转移率可达23%～26%，即有1／4的以往认为无淋巴结转移的病人已具有淋巴结转移，这对于进一步的治疗和预后的判断都十分有意义。

同样，在对骨髓的免疫组化检查中发现，用常规方法认为无骨髓受累的乳腺癌病人中有21%发现了骨髓中有转移灶，这种微小转移灶的发现，对临床治疗提供了可靠的依据。

6.在肿瘤分期上的意义判断肿瘤是原位还是有侵袭发生以及有无血管、淋巴管的侵袭是与肿瘤分期密切相关的。用常规病理组织学方法对于上述问题的判断有时是十分困难的，但用免疫组化检查可获得明确的结果。如采用层粘连蛋白（laminin）和Ⅳ型胶原的单克隆抗体可以清楚地显示基膜的主要成分，一旦证实上皮性癌突破了基膜，就不是原位癌，而是侵袭性癌了，其预后意义是不同的。已见到对乳腺癌、大肠癌、子宫颈癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌及恶性黑素瘤等肿瘤应用免疫组化研究基膜的报道。

采用第Ⅷ因子相关蛋白、UEA、凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的免疫组化方法则可清楚地显示肿瘤对血管或淋巴管的侵袭情况。对许多肿瘤的良、恶性鉴别以及有无血管或淋巴管的侵袭，是一主要的鉴别依据，同时对治疗方案的制定和预后的判断也有意义。

7.指导肿瘤的治疗应用免疫组化的检查结果不仅对肿瘤的诊断和鉴别诊断起到必不可少的作用，现在发现，在肿瘤的治疗上也有应用前景。如许多肿瘤对化疗不敏感，是由于瘤细胞内多药耐药基因（multidrug resitant gene）编码的酶的活性增加所致。如二氢叶酸还原酶以及P－糖蛋白增加，用免疫组化方法可以检测细胞内的这些酶或糖蛋白，以了解肿瘤是否有抗药性。其他还有p24蛋白、热休克蛋白、β生长转化因子等，也可通过免疫组化方法进行定位定量检查，探讨肿瘤的有效治疗途径。

随着免疫组化检测系统的不断进步，大量抗体的商品化和配套试剂盒的使用，目前该项技术已在医学基础研究和临床病理诊断等诸多领域得到广泛应用，成为一种重要的病理诊断辅助手段。